基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探究補陽還五湯的治療潛能及作用機制

雷歡，陳雪琴，胡錦玉，吳奇芝，段燕林，方海紅

江西科技師范大學，江西 南昌 330013

補陽還五湯是活血化瘀療法的代表性配方，最早由清代醫(yī)生王清任在當歸補血湯的基礎(chǔ)上創(chuàng)制。補陽還五湯具有益氣、活血通絡(luò)功效［1］。廣泛用于缺血性腦血管病、冠心病、心肌梗死和其他血栓栓塞疾病的預(yù)防和治療。補陽還五湯由七種中藥組成：黃芪、當歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花和地龍。鑒于我國擁有的豐富草藥資源，有必要對其進行深入研究并加以合理地開發(fā)與利用，為補陽還五湯的應(yīng)用創(chuàng)造更多的價值［2］。

隨著信息時代的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學已經(jīng)成為藥物機制研究和藥物開發(fā)的新途徑，包括探索藥物對疾病的基本藥理作用及其機制，分析中醫(yī)理論，以及研究中醫(yī)藥的應(yīng)用［3］。目前，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對補陽還五湯治療某一疾病作用的探討已有作者提出，如對心衰、心絞痛、動脈粥樣硬化等心血管疾病的研究［4-5］，以及糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的研究等［6-7］。補陽還五湯的多靶點、多通路特點，有治療多種疾病的優(yōu)勢，但未見文獻對其治療不同疾病潛能進行報道。基于此，本研究通過可視化技術(shù)將補陽還五湯生物網(wǎng)絡(luò)中“藥物-靶點-基因-疾病”間的大量信息及他們之間的相互作用的復(fù)雜聯(lián)系轉(zhuǎn)化為直觀的可視網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)關(guān)系預(yù)測或揭示藥物對機體的作用機制，以期為補陽還五湯的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 補陽還五湯生物活性成分和靶標的鑒定

補陽還五湯的中藥生物活性成分從藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP,http://ibts.hkbu.eAdu.hk/LSP/tcmsp.php），中醫(yī)百科全書（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）和文獻中獲得。根據(jù)ADME 的原則，設(shè)置OB ≥30%和BL ≥0.18 為閾值，獲得補陽還五湯的主要活性成分，并從上述數(shù)據(jù)庫獲得各成分的靶基因，通過UniPort 數(shù)據(jù)庫對所有靶基因進行了標準化。

1.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵靶點

將補陽還五湯靶點基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org) 進行蛋白分析，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，以置信度≥0.9 為篩查標準，將篩選后靶點信息導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.0 繪制并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analyzer 和CytoNCA 插件，根據(jù)連接度、介度、緊密度等參數(shù)分析并獲取網(wǎng)絡(luò)核心靶點。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

將核心靶點導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.Ncifcrf.gov/)進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。確定主要的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）和關(guān)鍵信號通路，并繪制GO 分析和KEGG 通路富集圖。

1.4 補陽還五湯治療疾病潛能預(yù)測

將富集的關(guān)鍵信號通路導(dǎo)入CTD 數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/），通過“Batch Query”查詢并下載各通路相關(guān)聯(lián)的疾病。將所有通路對應(yīng)的疾病以及出現(xiàn)頻次較多的疾病進行統(tǒng)計分析。

1.5 構(gòu)建“成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

為直觀呈現(xiàn)補陽還五湯對治療疾病的作用機制，將篩選的補陽還五湯活性成分、對應(yīng)的靶點、主要通路及對應(yīng)的疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 繪制可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 補陽還五湯生物活性成分和靶標的收集

從TCMSP、ETCM 數(shù)據(jù)庫和PubMed 文獻中獲得補陽還五湯的生物活性成分92 個，包括黃芪活性成分19 個、當歸成分7 個、赤芍成分14 個、川芎成分11 個、桃仁成分19 個、紅花成分16 個和地龍成分6 個。去除重復(fù)后獲得80 個補陽還五湯的活性化合物以及566 個相應(yīng)靶基因。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及篩選關(guān)鍵靶點

將補陽還五湯篩選的566 個靶基因?qū)隨TRING 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape3.9.0進行可視化，獲得459 個節(jié)點，2 523 條邊的網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖1 所示。

圖1 補陽還五湯核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 功能和KEGG 途徑富集分析

通過David 數(shù)據(jù)庫對459 個關(guān)鍵靶基因進行了富集和分析，共獲得1 444 個富集項目，包括237個MF，1 060 個BP 和147 個CC 類別，根據(jù)count值構(gòu)建了前10 項的條形圖（圖2）。在BP 類別中，排名靠前的包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；CC 組分排名靠前的包括細胞質(zhì)、細胞核等；MF 過程排名靠前的有蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等。KEGG 富集分析獲得1 016 條信號通路。根據(jù)count 值繪制了20 條關(guān)鍵信號通路的氣泡圖（圖3），主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、代謝作用等。

圖2 補陽還五湯作用靶點GO富集分析圖

圖3 補陽還五湯作用靶點KEGG通路富集分析圖

2.4 補陽還五湯治療疾病潛能預(yù)測

將前20 條KEGG 通路導(dǎo)入CTD 數(shù)據(jù)庫進行疾病分析，將所得到的疾病進行匯總，篩選出富集較為集中的為心腦血管疾病以及多種腫瘤，其中調(diào)控肝硬化、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肝癌、胃腫瘤等腫瘤的基因富集顯著。

2.5 “成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用Cytoscape 3.9.0軟件建立補陽還五湯“成分-靶點-通路-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，見圖4，清楚地展現(xiàn)補陽還五湯的活性成分、通路、靶點與不同疾病的作用關(guān)系，也揭示補陽還五湯的藥效作用機制。

圖4 補陽還五湯治療多疾病的“成分-靶點-通路-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

3 討論

補陽還五湯是一個經(jīng)典的中藥方劑，廣泛用于緩解神經(jīng)功能障礙和改善氣虛血瘀型冠心病［8］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討補陽還五湯的治療潛能及作用機制，使用數(shù)據(jù)挖掘，從補陽還五湯的7 種中藥中獲得了92 個活性成分和556 個潛在目標。其中槲皮素、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A和二氫辣椒素等主要活性成分涉及的通路包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、代謝作用等信號通路，對心腦血管疾病及多種腫瘤具有較好的治療潛能。

中醫(yī)認為肝硬化后期辨證主要屬氣虛血瘀，補陽還五湯能補氣活血、化瘀通絡(luò)，正切合本病病機。有研究［9］表明它能改善微循環(huán)，對抗增生性炎癥，還可降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶。乳腺腫瘤前期臨床表現(xiàn)為乳房腫塊、脹痛等，病機多為肝郁氣滯之實證，常選用補陽還五湯加減［10］。槲皮素具有抑制腫瘤細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的作用，在抗肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌及膀胱癌中發(fā)揮的藥理作用與使用劑量都已得到國內(nèi)外的廣泛認可，且大多都呈現(xiàn)劑量與時間的依賴性［11-12］。川芎嗪具有抑制白血病、乳腺癌、前列腺腫瘤等多種惡性腫瘤的作用［13-14］。羥基紅花黃色素 A 是中藥紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛功效相關(guān)的有效成分之一，研究表明，羥基紅花黃色素 A 除了抗心肌缺血作用外，還具有抗腦缺血，改善認知，抗帕金森病，降血糖，抗癌，改善肺、肝、腎及骨組織功能等多種藥理作用［15］。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法對補陽還五湯作用的關(guān)鍵通路與治療潛能進行了分析。補陽還五湯可能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、代謝作用等信號通路，改善心腦血管疾病，同時對肝硬化、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肝癌、胃腫瘤等疾病具有較好治療潛能，為補陽還五湯治療腫瘤等疾病提供了理論依據(jù)。