附子江西特色炮制品種“臨江片”炮制工藝研究

張鈺祺，顏干明，龔千鋒，于歡

1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004；2.萍鄉市食品藥品檢驗所，江西 萍鄉 337055

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品［1］。始載于《神農本草經》，其功效能上助心陽，中溫脾陽，下補腎陽。附子藥效顯著，但因其生品有大毒，臨床上多用其炮制品。附子的炮制方法歷代以來有火制、輔料制等多種方法［2］，其中江西特色中藥炮制流派“樟幫”采用米泔水漂，加入姜片蒸制，使附子炮生為熟，以達到減毒增效的作用，飲片命名為“臨江片”；是“樟幫”一大特色優勢飲片［3］。

目前關于該傳統飲片的相關報道十分少見，其炮制工藝、質量標準缺乏。據《樟樹中藥炮制全書》記載［4］，其炮制方法為：將鹽附子洗去鹽分，冷水漂1～2 d，用竹刀刮去外皮，清水漂凈，切成2～3分(約0.66～0.99 cm)厚橫片，再用米泔水漂2～3 d（早、中、晚換米泔水1 次），取出加生姜片拌勻，最后置蒸籠中蒸至透心，倒入大篩內用扇子扇涼，使其結面，邊扇邊鋪開藥片，烘干（先用大火，后用小火，經常翻動）。由于缺乏具體的工藝參數，其炮制技術經驗性強，生產上受到一定的影響，臨床應用亦受到限制。

為繼承和發展傳統炮制方法，本研究采用正交設計試驗方法，結合多指標綜合加權分析，優選出臨江片的炮制工藝，進一步發掘并整理其特色炮制工藝，以期為臨江片的生產和使用提供參考［5］。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate3000 液相色譜儀，PDA-3000 二極管陣列紫外檢測器，Chromeleon 工作站，Sartorius BS214-D 天平（萬分之一），Mettler AE240 天平（十萬分之一），HY-4 調速多用振蕩器，GZX-9076MBE電熱鼓風干燥箱等。

1.2 材料

烏頭堿對照品（批號：PF191204-26，純度：98.52%）購于美國Stanford Chemicals 公司。新烏頭堿對照品（批號：110799-201608，純度：98.5%），次烏頭堿對照品（批號：110798-202010，純度：99.2%），苯甲酰烏頭原堿（批號：111794-202006，純度：99.5%），苯甲酰新烏頭原堿（批號：111795-201805，純度：93.1%），苯甲酰次烏頭原堿（批號：111796-201906，純度：96.4%）購于中國食品藥品檢定研究院。鹽附子采自四川江油，經江西中醫藥大學藥學院龔千鋒教授鑒定為鹽附子。甲醇、乙腈均為色譜純。

鹽附片的制備方法：取鹽附子，洗凈，加入30倍量的清水，浸漂7 d，每日換水2 次。將浸漂后的鹽附子置75 ℃烘箱內烘1.5 h 后取出，切成3 mm厚片，繼續烘2 h，即得。

臨江片的制備方法：鹽附子洗去表面鹽分，清水浸漂2 d，每天換水2 次（春夏季節為防止腐敗，換水為3 次/d），撈出，刮去外皮，洗凈，切6～9 mm厚橫片，再用米泔水漂3 d（早、中、晚各換水1 次），撈出。輔料生姜用量、蒸制時間、烘干溫度以及烘干時間按照L9（34）正交表進行試驗，分別得到9 份臨江片樣品。

2 方法與結果

2.1 總生物堿的含量測定［6］

分別取臨江片正交試驗樣品粉末10 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷-乙醚（1∶3）的混合溶液50 mL，以及氨試液4 mL，密塞，搖勻，放置陰涼處12 h 以上，濾過，藥渣加上述混合溶液50 mL，連續振搖1 h，靜置后過濾，藥渣再用上述混合溶液洗滌3 至4 次，每次20 mL，濾過，合并洗液與濾液，水浴蒸干。殘渣加乙醇10 mL 使溶解，轉移至錐形瓶中，精密加入硫酸滴定液（0.01 mol/L）15 mL，水15 mL 與甲基紅指示劑3 滴，用氫氧化鈉滴定液（0.02 mo1/L）滴至黃色。每1 mL 硫酸滴定液（0.01 mol/L）相當于12.9 mg 的烏頭堿（C34H47NO11）。

2.2 雙酯型生物堿、單酯型生物堿含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-40 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫：0～10 min，15%→25%乙腈，10～25 min，25%～30%乙腈，25～35 min，70%乙腈，35～50 min，30% →38% 乙 腈，50～70 min，38% →50%乙腈；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）及鹽附片（B）的 HPLC 圖

2.2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取烏頭堿對照品7.27 mg、次烏頭堿對照品9.84 mg、新烏頭堿對照品10.06 mg、苯甲酰烏頭原堿對照品3.84 mg、苯甲酰新烏頭原堿對照品3.02 mg、苯甲酰次烏頭原堿對照品3.00 mg，置5 mL 量瓶中，加入0.05 %鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取鹽附片、臨江片樣品細粉約4 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加入4 mL 濃氨水，浸潤0.5 h，再加入乙醚75 mL，密塞，陰涼處放置12 h 以上，超聲提取10 min，過濾，藥渣加乙醚洗滌3 次，每次25 mL，濾過，合并洗液與濾液，水浴蒸干。殘渣加0.05% 鹽酸甲醇溶液使溶解，轉移至2 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取上述混合對照品溶液50、100、200、300、400、500 μL 分別置于5 mL容量瓶中，用0.05%鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20 μL。以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）制作標準曲線，回歸方程分別為：新烏頭堿y=196.51x+0.602，r=0.997 9，線性范圍0.021～0.210 mg/mL；烏頭堿y=197.3x+0.205 4，r=0.998 6，線性范圍0.014～0.143 mg/mL；次烏頭堿y=238.63x-1.353 1，r=0.999 8，線性范圍0.019～0.195 mg/mL；苯甲酰新烏頭原堿y=193.76x-0.156 2，r=0.999 6，線性范圍0.006～0.056 mg/mL；苯甲酰烏頭原堿y=181.9x-0.406 2，r=0.998 3，線性范圍0.007～0.077 mg/mL；苯甲酰次烏頭原堿y=111.25x+0.079 5，r=0.996 2，線性范圍0.006～ 0.058 mg/mL；表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 取鹽附片樣品細粉，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，進樣體積為20 μL。測得樣品中6 種生物堿對照品面積的RSD分別為1.50%、1.21%、0.90%、2.38%、1.72%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重現性試驗 取同一批鹽附片樣品細粉6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項下色譜條件進樣，進樣體積為20 μL。測得樣品中6 種生物堿面積的RSD 分別為0.86%、0.38%、0.68%、0.54%、2.17%、1.89%，表明該方法重現性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取同一鹽附片樣品溶液,分別于0、4、8、16、24 h 進樣，進樣體積為20 μL。測得樣品中6 種生物堿面積的RSD 分別為0.32%、1.25%、0.85%、1.78%、1.49%、0.54%，表明該方法穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知6 種生物堿含量的鹽附片細粉6 份，每份約2 g，精密稱定。分別精密加入“2.2.2”項下混合對照品溶液0.5 mL，按“2.2.3”項下方法進行制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定并計算回收率。結果6 種生物堿的平均回收率分別為101.1%（RSD 1.49%）、99.8%（RSD 0.96%）、100.90%（RSD 1.98%）、98.9%（RSD 2.08%）、101.3%（RSD 1.78%）、99.99%（RSD 2.11%）。

2.2.9 樣品含量測定 分別取臨江片正交試驗樣品細粉4 g，精密稱定，照“2.2.3”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，進樣體積為20 μL，測得樣品中6 種生物堿的相應峰面積。

2.3 浸出物含量

分別取臨江片正交試驗樣品細粉4 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h 后，加熱回流1 h，加入適量水補足減失重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸至近干，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，精密稱定。9 份試驗樣品平行操作，分別計算浸出物含量。

2.4 正交試驗

2.4.1 因素和水平 依據臨江片傳統的炮制方法，分別考察蒸制時間（A）、輔料生姜用量（B）、烘干溫度（C）和烘干時間（D），選用L9（34）正交表進行試驗，具體見表1。雙酯型生物堿含量為新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的含量之和，單酯型生物堿含量為苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量之和［7］。采用多指標綜合加權評分方法進行評分，具體權重為：總生物堿、雙酯型生物堿和單酯型生物堿均為附子的主要有效成分，其含量占權重均為30% ；浸出物為評價飲片質量的重要指標，其含量占權重10%。各指標均為越高越好，計算方法為：綜合分=總生物堿含量/最大值×100×30%+雙酯型生物堿含量/最大值×100×30%+單酯型生物堿含量/最大值×100×30%+浸出物含量/最大值×100×10%。

表1 L9（34）正交試驗設計與結果

2.4.2 正交試驗結果 取9 份鹽附子各200 g，按表2 中的試驗設計，加入不同比例的生姜片拌勻，蒸制不同時間，攤開放置待其冷卻至室溫，在不同溫度下，烘干不同時間，得到9 份樣品。取每份樣品進行測定，結果見表1，采用正交設計助手V3.1 版計算機軟件對綜合評分進行方差分析，方差分析見表2。

表2 方差分析

通過方差分析［8］，烘干溫度和蒸制時間對結果具有顯著影響，四個因素的影響程度為C＞A＞D＞B，故得到臨江片的最佳炮制工藝為A3B3C2D1，即：加入12%的生姜片，蒸制10 h 后，70 ℃烘4 h。

2.4.3 炮制工藝驗證試驗 按照優選的炮制工藝，制備3 批樣品，分別測定各指標，總生物堿含量、雙酯型生物堿含量、單酯型生物堿含量、浸出物含量以及綜合評分結果見表3。驗證試驗與正交試驗優選結果相近，說明優選的炮制方法穩定可行。

表3 驗證試驗結果 分

3 討論

附子主含生物堿類成分，其雙酯型生物堿既是主要的藥理活性成分，同時也是主要的毒性成分［9］。經水解后的雙酯型生物堿轉變為單酯型生物堿，其毒性明顯降低，進一步水解為胺醇類堿后毒性更?。?0］。臨江片采用的炮制方式是蒸制和姜制兩種，其中蒸制由于是隔水蒸，能有效避免附子長時間與水接觸而使生物堿大量流失，同時高溫高濕的環境能較好地將雙酯型生物堿轉化為單酯型生物堿，減毒效果顯著，蒸制還可使附子中的淀粉充分糊化，成品呈角質樣，質地堅硬，因此不易蟲蛀、易于保管，同時飲片中的成分相對均勻穩定，醫生處方時易于掌握劑量［3,11］。生姜作為輔料自古與附子配伍以達到增效的功效,《本草綱目》記載“附子得生姜則能發散，以熱攻熱，又導虛熱下行，以除冷病”，姜制可使附子功效增加。蒸制減毒與姜制增效，使得臨江片獨具特色和功效［3］。

為證明其減毒的效果，實驗采用HPLC 法建立了酯型生物堿的含量測定方法，可同時檢測附子中的6 種酯型生物堿，方法操作簡單，穩定可行。對比了鹽附片和臨江片的生物堿含量變化情況后發現：鹽附子經樟幫法炮制為臨江片后，雙酯型生物堿含量大大下降，從221 μg/g 下降至25 μg/g，單酯型生物堿含量顯著增加，從55 μg/g 增加至240μg/g，總生物堿含量從175 μg/g 增加至239 μg/g，證明樟幫法炮制附子能有效地保留生物堿成分，同時降低了毒性成分的含量，符合附子炮制減毒增效的目的。

實驗首次使用多指標綜合加權分析法優選臨江片的炮制工藝，以總生物堿、雙酯型生物堿、單酯型生物堿以及浸出物為考察指標。通過預試驗，篩選出影響臨江片成分和活性影響較大的因素，即生姜用量、蒸制時間、烘干溫度以及烘干時間。通過正交試驗，確定了臨江片的最佳炮制工藝，即：加入12%的生姜片，蒸制10 h 后，70 ℃烘4 h，炮制出的飲片，片形美觀，質地堅硬，半透明，呈角質樣光澤，且有姜香氣，極少灰屑，符合原書記載，可為今后發展與應用臨江片這一優勢傳統飲片提供炮制工藝技術參考。