強力枇杷露抑菌效力的影響因素考察

張靜，熊樂樂，章瑛，張春華，熊蔚

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

強力枇杷露具養陰斂肺，鎮咳祛痰的功效，用于久咳勞嗽，支氣管炎等的治療。原標準收載于中華人民共和國衛生部藥品標準中藥成方制劑第二冊WS3-B-0442-90［1］，現行標準為《中國藥典》2020年一部［2］。強力枇杷露是由枇杷葉、罌粟殼、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷腦等七味中藥和蔗糖制成，含適量枸櫞酸、香精和苯甲酸鈉，含蔗糖量為60%（g/mL），為高濃度蔗糖水溶液。

強力枇杷露因服用方便、吸收快速、效果顯著、病人接受程度高等特點而獲得廣泛使用，大多為多劑量包裝［3］。根據《中國藥典》2020 年版四部［4］通則0116 糖漿劑項下規定，糖漿劑在制劑處方確定之初，該處方的抑菌效力就應符合抑菌效力檢查法。強力枇杷露處方中使用的抑菌劑為苯甲酸鈉，處方含量為0.25%。而《中國藥典》2020 年版與2015 年版在抑菌效力檢查法上最大的不同在于：除了考慮不同種類型的菌落，包括革蘭陽性菌（金黃色葡萄球菌），革蘭陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌），致病酵母菌（白色念珠菌）和霉菌（黑曲霉），還特別提出若需要，制劑中常見的污染微生物也可作為試驗菌株，例如高濃度糖的口服溶液還應選用魯氏酵母作為試驗菌株。魯氏酵母是最常見的耐高滲酵母，能在高濃度的蔗糖溶液中生長，但目前為止尚未發現魯氏酵母對人類存在致病性。

因此，本研究擬參照《中國藥典》2020 年版四部通則1121 抑菌效力檢查法對不同企業的不同有效期、不同pH 值、不同水活度的強力枇杷露抑菌效力進行考察，除常見的五株菌外另選用魯氏酵母進行抑菌考察［5］。同時制備缺罌粟殼的陰性樣品，使用枸櫞酸調節pH、蔗糖調節水活度，考察樣品在不同pH、不同水活度情況下，對所添加的抑菌劑苯甲酸鈉抑菌效力的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YXQ-LS-50S Ⅱ型高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業醫療器械有限公司）；SW-CJ-2D 凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；PYX-DHS 細菌培養箱（上海躍進醫療器械廠）；KB400 霉菌培養箱（BINDER 公司）；HH.W21.600S 電熱恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械廠）；FE20K pH 計和Sartorious T601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Aqualab 4TEV 水分活度測定儀和PE20K 酸度計（METTLER TOLEDO）。

1.2 菌種

魯氏酵母（Saccharomyces rouxii）購自國家菌種保藏中心，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、白色念珠菌（Candida albicans）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 培養基與試劑

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）（青島海博生物技術有限公司），胰酪大豆胨瓊脂培養基（北京三藥科技開發有限公司），沙氏葡萄糖液體培養基（北京陸橋技術股份有限公司），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司），苯甲酸鈉（批號：100433-201702，含量 99.7%，中國食品藥品檢定研究院），蔗糖（批號：20201105，分析純，廊坊鵬彩精細化工有限公司），薄荷腦（批號：20210317，含量99.0%，江西華豫源生物科技有限公司），枇杷葉、百部、白前、桑白皮、桔梗等飲片均購自市售連鎖藥店。

1.4 樣品

強力枇杷露9 批次，來源于日常抽檢及市場采購。具體樣品信息詳見表1。

表1 強力枇杷露樣品信息

2 方法與結果

2.1 自制樣品和菌懸液的制備

2.1.1 自制樣品的制備 取枇杷葉69 g、百部15 g、白前9 g、桑白皮6 g、桔梗6g 等五味藥材飲片加水煎煮兩次，每次加水2 L，煎煮2 h，合并藥液，濾過，濾液濃縮至500 mL，加蔗糖600 g，加熱至沸騰并保持20 min，靜置1 h，濾過，加入用乙醇溶解的0.15 g 薄荷腦，攪拌混勻，靜置，濾過，并加水至1 000 mL。取上述溶液9 份，每份100 mL，使用枸櫞酸調節不同pH，加入蔗糖調節不同水活度。添加抑菌劑苯甲酸鈉（濃度以酸計）使濃度分別為0.15%、0.20%、0.25%。具體數據詳見表2。

表2 自制樣品信息及抑菌實驗結果

2.1.2 菌懸液的制備 取魯氏酵母、白色念珠菌、黑曲霉分別接種至沙氏葡萄糖液體培養基中，25 ℃培養48 h，作為新鮮培養物；魯氏酵母、白色念珠菌新鮮培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至濃度分別為106cfu/mL 和107cfu/mL 的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物繼續培養1 周后用含0.05 %聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含孢子數107cfu/mL 的孢子懸液。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌分別接種至胰酪胨大豆肉湯培養基中35 ℃培養24 h，作為新鮮培養物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至濃度均為108cfu/mL 的菌懸液。

2.2 水活度測定

分別取“1.4”和“2.1.1”項下市售和自制強力枇杷露在25 ℃條件下用水活度儀測定水活度，每份樣品平行測定3 次，取平均值。結果見表1、表2。

2.3 方法適用性試驗

對9 批次強力枇杷露進行方法適用性試驗。經過驗證，不同企業的強力枇杷露均可使用以下方法進行計數，六株菌的回收率均在0.8 以上，符合《中國藥典》2020 年版四部通則1105 非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法的要求。在該方法下，能有效檢出強力枇杷露中的含菌數。具體方法見表3。

表3 強力枇杷露微生物方法學

2.4 抑菌效力測定

每批樣品取6 支試管，每支試管加入樣品9.9 mL，再分別加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、魯氏酵母、白色念珠菌、黑曲霉0.1 mL，充分混勻，使試驗菌在樣品中分布均勻，接種后的樣品中染菌量為105～107cfu/mL。接種后樣品避光，置25 ℃培養箱中。9 批次市售強力枇杷露和9 批次自制樣品在接種后0 d、14 d、28 d 分別取樣，對菌落數進行計數。抑菌效力判斷標準參照《中國藥典》2020 年版四部通則1121 抑菌效力檢查法中口服制劑：細菌在接種后14 d 下降3 個lg 值，至28 d 時無增長；真菌在接種后14 d 下降1 個lg 值，至28 d 時無增長。

2.5 抑菌實驗結果

2.5.1 市售樣品的抑菌效力 9 批次強力枇杷露均通過抑菌效力挑戰實驗，在接種后14 d 細菌和真菌均為0，lg值均下降5～7，且在28 d時細菌和真菌均為0，lg 值均未增加。

2.5.2 自制樣品的抑菌效力 抑菌效力考察結果顯示，9 批次自制樣品共有5 批次通過抑菌效力挑戰實驗。苯甲酸鈉（以酸計）添加量0.25%時，3 批次自制樣品均通過挑戰實驗；添加量0.20%時，其中2 批次通過挑戰實驗（pH6.5，水活度0.967 1 時1 批次未通過挑戰實驗）；添加量0.15%時，3 批次自制樣品均未通過挑戰實驗。具體詳見圖1。

圖1 自制樣品9批次對6株菌的影響

3 討論

3.1 不同有效期對抑菌效力的影響

同一企業3 批次不同有效期（生產3 個月內1 批、距離保質期一年1 批、保質期3 個月內1 批）強力枇杷露均通過抑菌效力考察，且3 批次樣品在14 d內需氧菌和真菌均未有生長。說明強力枇杷露在保質期內抑菌劑濃度變化不大，抑菌效力受有效期影響不大。

3.2 pH 值對抑菌效力的影響

9 批次不同pH 值的市售樣品，均通過抑菌效力考察。但是在自制樣品中，pH 值與苯甲酸鈉的濃度對抑菌效力的影響較為明顯。當陰性樣品pH低于4.5 時，苯甲酸鈉（以酸計）添加濃度為0.20%即可通過抑菌效力檢查，表明抑菌劑的抑菌效力受pH 影響較大。提示在苯甲酸鈉（以酸計）添加濃度在一定范圍時，pH 對液體制劑中的苯甲酸鈉的抑菌效力起主導作用，抑菌劑苯甲酸鈉的有效抑菌取決于其非解離狀態，與制劑的pH 息息相關。苯甲酸鈉的最佳使用pH 在2.5～4.5 之間，pH 大于5幾乎無抗菌活性。抑菌體系中抑菌劑苯甲酸鈉的抑菌活性與自制樣品的pH 成反比關系，一定范圍內，制劑的pH 越低，苯甲酸鈉抑菌效果越好［6-7］。

3.3 水活度對抑菌效力的影響

口服液體制劑的水活度較高，且根據處方工藝的不同，不同企業不同制劑水活度相差也較大。本研究中幾批次強力枇杷露的水活度在0.95～0.97 之間，隨著水活度的增加，不同菌的生長速率也有很大增長，尤其是在對制劑pH 做出調整之后，水活度對制劑的抑菌效力影響很大。能否利用水活度的概念來控制中藥制劑中微生物的增長是當前的研究熱點［8-9］。表4 為常見6 株菌生長所需的最低水活度。

表4 菌株生長所需的最低水活度

苯甲酸鈉是藥品中常用的安全、低毒、高效抑菌劑，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、致病酵母菌和霉菌均具有良好的抑制作用。根據以上實驗結果，強力枇杷露的抑菌體系的構建較為合理，能較好地抵御微生物污染風險。不過該抑菌體系依然存在可以優化的地方，結合藥物的理化性質在一定pH 范圍內控制水活度，可以減少抑菌劑的添加量以達到更好的抑菌效力。