EMS誘變對岷江百合種子萌發的影響

金 鴿, 張銘芳, 魏 蕾, 韓東洋, 杜運鵬, 楊鳳萍, 薛 靜, 陳緒清, 張秀海, 董 然

(1.吉林農業大學林學與草學學院, 長春 130118;2.北京市農林科學院,農業農村部華北都市農業重點實驗室, 北京 100097)

百合為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本植物,具地下鱗莖,是常見的觀賞花卉,同時也具有食藥用價值[1]。岷江百合(LiliumregaleWilson)別名王百合、千葉百合,天然分布于我國四川岷江流域海拔760～2 200 m氣候變化劇烈的干旱河谷區域,對寒冷天氣抵抗能力較強,同時對酸堿性土壤及石灰土也具有一定的抵抗能力,在土壤pH值達8.5的環境中仍能正常生長開花[2],具有抗病毒能力強的優點[3]。

甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate,EMS)是典型的化學誘變劑,目前在許多植物的突變體育種研究及種質資源的創制中取得一定進展[4]。化學誘變育種具有使用方便、特異性較強和誘變后代較易穩定遺傳的特點。通過化學誘變劑對農作物誘變后代進行多世代篩選、鑒定,已經培育出具有生產利用價值的農作物新品種。其中EMS化學誘變技術是創造新種質,改良農藝性狀的常用方法,相比于其他誘變劑,EMS誘變劑應用效果較好。EMS直接作用于DNA鳥嘌呤部分引起點突變及染色體損傷。EMS誘變產生點突變的頻率較高,而誘發染色體畸變相對較少,且誘變產生的突變體多為顯性突變體,易于進行突變體的田間篩選。目前,EMS誘變已經廣泛的應用于西蘭花種子[5],刺梨種子[6],藜麥種子[7-9],高粱種子[10],黨參種子[11],燕麥種子[12],木槿種子[13],醉魚草種子[14],紅豆草種子[15]等。王育川等[9]以自育白種藜麥種子為實驗材料,設置5個濃度(0.5%,1.0%,1.5%、2.0%,2.5%)的EMS緩沖液和4個時間(8,10,12,14 h)進行誘變處理,來確定半致死劑量[9]。閆鋒等[16]用EMS(0.3%,0.6%,0.9%,1.2%)處理(6,10,1,4 h)糜子種子,來篩選建立糜子突變體庫的適宜條件。于震宇[17]以金花葵種子為實驗材料,設置不同的EMS濃度(0.4%,0.8%,1.2%,1.6%,2.0%)來篩選出EMS最佳處理濃度。

但是目前關于對百合種子的EMS誘變研究較少,田鑫等[18]以湖北百合鱗片為試材,首先采用9種不同培養基接種,獲得誘導愈傷組織最佳配方,然后以該配方誘導出的愈傷組織為誘變材料,用EMS(0.2%,0.4%,0.6%)處理(1,2,3 h)愈傷組織,對誘變處理的愈傷組織分化的不定芽用0.4%濃度的NaCl脅迫處理0～12 d進行鹽脅迫篩選,獲得復合誘變處理后的最佳耐鹽濃度。劉艷妮等[19]用EMS對百合離體葉片進行處理,篩選出其半致死濃度為0.6%和處理3 h。利用篩選出來的EMS濃度和處理時間對離體葉片進行處理,在1%鹽濃度脅迫下進行抗鹽性突變體篩選,得到抗鹽性誘變植株。其研究認為篩選出來的百合突變體比對照具有更強的抗鹽性。

目前,關于百合的EMS處理,較多是應用于離體組織,沒有對種子的處理。本研究利用不同濃度的EMS和不同處理時間對岷江百合種子進行誘變處理,目的是篩選出未經沙藏處理的種子以及經過沙藏處理的種子最佳的誘變濃度和誘變時間,為創新種質資源、選育百合新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合種子取于北京農林科學院百合種植基地。化學誘變劑EMS為Solarbio品牌,為無色透明的油狀液體。

1.2 試驗設計

處理分為干種子組和沙藏種子組,干種子為岷江百合自交種子,沙藏種子組為岷江百合自交種子經過一個月的沙藏處理。用不同濃度的EMS(0,0.4%,0.8%,1.2%)處理百合種子2 h,4 h,8 h,每個處理3個重復。

1.3 試驗流程

挑選胚部成熟的種子進行實驗處理,3次重復,每個重復30粒種子,將種子及溶液放于50 mL的離心管中,放于28 ℃,200 r/min,在處理過程中偶爾翻轉離心管,以保證種子與誘變劑充分反應。處理完成后,用自來水晃洗10次,上下搖晃30次,將種子倒在篩網中,流水沖洗30 min,以終止反應。處理完成后,在EMS溶液中加入1 mol/L的NaOH溶液,對EMS溶液進行消毒。

將處理完成后的種子均勻地鋪在墊有濕潤濾紙的培養皿上,進行培養,然后不定期對種子進行澆水,浸濕濾紙即可。

1.4 指標測定

在種子萌發第9,13,17天分別測定種子的發芽勢、發芽率、成活率以及種子誘變當天的電導率。其中發芽的標準為只要種子萌發,即為發芽。

發芽勢/%=(第9天種子發芽數/供試種子數)×100%;

發芽率/%=(第13天種子發芽數/供試種子數)×100%;

成活率/%=(第17天幼苗成活數/供試種子數)×100%;

相對發芽率/%=(處理組的發芽率/對照組的發芽率)×100%。

電導率的測定:挑選飽滿的種子,每組9粒,稱重,進行EMS處理,沖洗30 min后,用濾紙將水吸干,于10 mL蒸餾水浸泡30 min,用電導儀測定浸出液的電導率,以靜置0.5 h的蒸餾水電導率為空白(ck),3次重復。每克處理樣品種子浸出液電導率[mS/(cm·g)]=(測定電導率-空白電導率)/樣品重量。

1.5 數據處理

采用SPSS 20.0數據處理軟件進行方差分析,實驗數據采用Excel軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對種子發芽勢的影響

由圖1可見,岷江百合干種子和經過沙藏處理的種子,其發芽勢都顯著受到EMS誘變劑處理時間及濃度的影響。

干種子在同一處理濃度下,各個處理的發芽勢隨著EMS處理時間的延長而逐漸降低,0.4%EMS濃度處理2 h時其發芽勢接近于濃度為0處理的對照種子,而在處理4 h和8 h時,其發芽勢顯著低于對照組。在0.8%EMS濃度處理4 h時,有部分種子發芽,而隨著處理時間延長到8 h,種子的發芽數量極少。在同一處理時間下,各個處理的發芽勢隨著處理濃度的增加而逐漸降低。當處理時間為2 h,處理濃度從0.8%增加到1.2%時,其發芽勢從9%將至0,發芽勢顯著下降。可見當處理時間為2 h,4 h,8 h時,不同濃度的EMS溶液處理干種子發芽勢依次為1.2%<0.8%<0.4%<0。

注:不同小寫字母為同一類型種子在相同濃度,不同處理時間的多重比較標識,不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 干種子及沙藏種子發芽勢Fig.1 Germination potential of dry seeds and sandy storage seeds

當沙藏種子經0及0.4%濃度處理時,隨著處理時間從2 h延長至8 h,其種子的發芽勢逐漸升高,而在0.8%濃度處理2 h時,其發芽勢開始隨著處理時間的延長而逐漸降低,最終在0.8%濃度處理8 h時,發芽勢由51%降至0。可見當處理時間為2 h,4 h,8 h時,不同濃度的EMS溶液處理干種子發芽勢依次為1.2%<0.8%<0.4%<0。同時,圖1也表明,在處理濃度為0時,經過沙藏處理種子的發芽勢整體高于干種子的發芽勢,說明種子在經過低溫沙藏處理時,其胚開始發育。在種子經過0.4%,0.8%,1.2%處理時,也同樣表明沙藏處理種子的發芽勢高于干種子的發芽勢,產生這種現象可能是由于種子在經過低溫沙藏處理時,種子的活力增加,所以對于EMS誘變的抵抗能力也相應地增強。

2.2 不同處理對種子發芽率的影響

由圖2可見,岷江百合干種子和經過沙藏處理的種子,其發芽率都顯著受到EMS誘變劑處理時間及濃度的影響。

圖2 干種子及沙藏種子發芽率Fig.2 Germination rate of dry seeds and sandy storage seeds

干種子在同一處理濃度下,各個處理的發芽率隨著EMS處理時間的延長而逐漸降低,在0.4%EMS濃度處理2 h時其發芽率為71%,而隨著EMS處理時間延長至8 h時,其發芽率降至13%。當種子由0.8%EMS濃度處理2 h,延長至8 h時,其發芽率由47%降至0。當種子由1.2%EMS濃度處理2 h,延長至8 h時,其發芽率由8%降至0。在同一處理時間下,各個處理的發芽率隨著處理濃度的增加,而逐漸降低。在處理時間都為2 h時,種子發芽率隨著處理濃度的增加而降低,發芽率分別為71%,57%,47%,8%。而當處理時間為8 h時,種子在0.8%、1.2%濃度時,發芽率都為0,可見濃度顯著抑制了種子的萌發。沙藏種子的發芽率在0.4%濃度處理時,其發芽率隨著處理時間的延長而增加,由42%逐漸增加至51%,而種子經0.8%、1.2%濃度處理時,其發芽率逐漸降低,最終其發芽率都為0。可見EMS顯著抑制了種子的萌發,對種子造成了致死性的傷害,但是由圖2可見,沙藏種子的發芽率整體上略高于干種子的發芽率。

2.3 不同處理對種子相對發芽率的影響

由圖3可見,隨著EMS濃度的升高,各個不同時間處理的相對發芽率逐漸降低。當EMS濃度為0.4%時,2 h處理的相對發芽率顯著高于經過4 h和8 h處理的種子。可見時間的延長,對種子的生長起到了顯著的抑制作用。但同時由于誘變劑作用的時間較短,所以濃度為0.4%,經過2 h處理時,其相對發芽率接近于對照組,說明此時對種子的毒害作用較弱。在4 h處理時,其相對發芽率為65.38%,接近半致死率,而當時間延長至8 h時,種子的相對發芽率約為對照組的1/4,這時對種子的發芽起到了顯著的抑制作用。當EMS濃度為0.8%時,分別經2 h,4 h,8 h處理后,其發芽率分別為65.63%,23.08%,0。當EMS濃度在1.2%時,種子的相對發芽率顯著低于對照組,經過2 h處理后,種子的相對發芽率為10.94%,而經過4 h和8 h處理后,種子的相對發芽率為0。綜上所述,并且結合種子的生長情況,EMS濃度為0.4%,處理時間為4 h時,其相對發芽率接近半致死率,故岷江百合干種子的最佳誘變濃度和時間分別為0.4%,4 h。

圖3 干種子相對發芽率Fig.3 Relative germination rate of dry seeds

由圖4可見,種子經0.4%濃度處理2 h時,其相對發芽率為62.3%,其較同樣處理條件下的干種子的相對發芽率要低近20%,而經4 h處理的種子比經過8 h處理的種子相對發芽率要高,這與同樣處理條件下的干種子相對發芽率趨勢相同。在0.8%濃度處理時,種子的相對發芽率在經2 h,4 h,8 h處理時,其相對發芽率分別為85.25%,37.50%,0。在經1.2%濃度處理時,種子的相對發芽率都極低,綜合比較,種子在經0.4%,2 h處理的相對發芽率接近半致死率,故岷江百合沙藏種子的最佳誘變濃度和時間分別為0.4%,2 h。

圖4 沙藏種子相對發芽率Fig.4 Relative germination rate of sandy storage seeds

2.4 不同處理對種子成活率的影響

由圖5可見,干種子在0,2 h處理時成活率為81%,此時生長狀態良好,在0.4%,4 h時成活率達到56%。而沙藏處理的種子在0,2 h處理時成活率為72%,在0.4%,8 h處理時成活率達53%。在1.20%,2 h處理下,沙藏種子的成活率高于干種子的成活率,約為干種子成活率的3倍。可見隨著EMS濃度的增加,百合種子的成活率逐漸降低,經過0.8%處理的種子,部分發生腐爛的情況,生長出來的幼苗整體偏小,而且有部分幼苗出現腐爛。經過1.2%濃度處理的種子,大部分存在腐爛壞死的現象,在芽尖處及種子表面發生腐爛現象。

圖5 干種子及沙藏種子成活率Fig.5 Survival rate of dry seeds and sandy storage seeds

2.5 不同處理對種子浸泡液相對電導率的影響

由圖6可見,種子浸泡液的電導率反映了細胞膜的受損程度,干種子在0.8%,2 h處理時,電導率最大,而后隨著處理時間的延長和濃度的增加,電導率逐漸減小。沙藏種子在0.8%,4 h處理時,電導率達到最大,而后隨著處理時間的延長和濃度的增加,電導率逐漸減小,而沙藏種子的電導率整體略高于干種子電導率。

圖6 干種子及沙藏種子電導率Fig.6 Conductivity of dry seeds and sandy storage seeds

注:A,B,C,D分別為0,0.4%,0.8%,1.2%EMS濃度處理的種子,其中a代表處理2 h,第9天生長狀況;b代表處理4 h,第9天生長狀況;c代表處理8 h,第9天生長狀況;d代表處理2 h,第13天生長狀況;e代表處理4 h,第13天生長狀況;f代表處理8 h,第13天生長狀況;g代表處理2 h,第17天生長狀況;h代表處理4 h,第17天生長狀況;i代表處理8 h,第17天生長狀況。圖7 干種子生長狀況Fig.7 Dry seed growth status

2.6 不同處理時種子胚長及根的生長狀況

EMS濃度為0時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子生長狀況見圖7。由圖7可以看出,濃度為0處理的種子發芽速度及生長速度較快。EMS濃度為0.4%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發芽速度比濃度為0處理的種子發芽及生長速度明顯慢很多。尤其到生長第17天的時候,兩者生長大小差異較大。這是由于EMS誘變劑對種子細胞造成了一定的傷害,對種子的發芽具有明顯的抑制作用。EMS濃度為0.8%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發芽速度比0.4%濃度處理的種子發芽及生長速度明顯慢。且在0.8%濃度處理2 h及4 h的種子在第9天可以看見芽,而到了第13天,出現了腐爛。在第9天時,2 h,4 h,8 h芽生長的不明顯,而到了第13天部分種子芽才可見。EMS濃度為1.2%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子的生長明顯受到抑制,導致出芽率極低,甚至部分種子發生腐爛現象。

EMS濃度為0時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子生長狀況見圖8,由圖8可以看出,濃度為0處理的沙藏種子發芽速度比干種子發芽及生長速度快,主要是因為種子在經過低溫沙藏過程中已經開始萌發,細胞內各種酶活性開始提升。EMS濃度為0.4%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發芽速度比濃度為0處理的種子發芽及生長速度略慢,但是相比于干種子,生長較快。EMS濃度為0.8%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時種子發芽速度比0.4%濃度處理的種子發芽及生長速度明顯減慢,而且在4 h和8 h處理的種子發芽不顯著,可見EMS對種子發芽的抑制較為明顯。EMS濃度為1.2%時,處理時間分別為2 h,4 h,8 h,在第9,13,17天時,沙藏種子和干種子一樣,其生長明顯受到抑制,導致出芽率極低,甚至部分種子發生腐爛現象。

圖8 沙藏種子生長狀況Fig.8 Growth status of sandy storage seeds

3 結論與討論

在培育新品種上,經常使用EMS對種子或者植物組織等進行誘變處理,EMS誘發的突變主要通過兩個步驟來完成,首先,鳥嘌呤的N-7位置被烷基化,成為一個帶正電荷的季銨基團,從而發生兩種遺傳效應:一是烷化的鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,代替胞嘧啶,發生轉換型的突變;二是由于鳥嘌呤的N-7烷基活化,糖苷鍵斷裂造成脫嘌而后在DNA復制過程中,烷基化鳥嘌呤與胸腺嘧啶配對,導致堿基替換,即G∶C變為A∶T[20]。EMS誘變可以實現在短期內獲得大量的突變體,構建突變體庫,具有其他誘變育種方式所不具備的優點,因此常被現代育種學家用于大規模突變研究[21]。

本試驗結果表明,干種子在0.4%,4 h處理時相對成活率達到65.38%,接近半致死劑量。而沙藏處理的種子在0.4%,2 h時相對成活率達62.3%,接近半致死劑量。因此,0.4%的EMS,處理4 h為EMS處理百合干種子的較適宜方式,0.4%濃度的EMS,處理2 h為EMS處理沙藏種子較適宜方式。馬海新等[22]研究表明,4%濃度的EMS,2 h處理,對加工西紅柿干種子處理的發芽率為45%,接近半致死劑量;3%濃度的EMS,12 h處理對加工西紅柿濕種子處理的發芽率為61%,接近半致死劑量。安佰義等[23]研究表明,EMS誘變處理白樺種子的適宜條件為1.0%處理5 h或0.4%處理7 h。續言等[24]研究結果表明,4%濃度的EMS處理尾葉紫薇8 h和12 h后全部致死。2%濃度處理4 h的相對致死率為48.18%,接近半致死濃度。這說明不同種子對EMS的敏感性差異較大,誘變效果存在很大不同。并且隨著EMS濃度的增加以及處理時間的延長,對種子的萌發及生長抑制作用就越來越顯著。周厚成等[25]用不同濃度EMS對草莓愈傷組織進行誘變處理,結果表明,隨著EMS處理濃度的增加和時間的延長,愈傷組織死亡率呈上升趨勢;所以EMS處理種子及其他愈傷組織,均會起到抑制生長的作用。