壯藥材小花青藤中非堿成分分析

徐娟娟,譚欽剛,2*

(1.桂林醫(yī)學(xué)院,廣西 桂林 541199;2.植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國科學(xué)院昆明植物研究所,云南 昆明 650201)

小花青藤(IlligeraparvifloraDunn)為蓮葉桐科(Hernandiacea)青藤屬(Illigera)植物。分布于福建、廣東、廣西、貴州、云南等地,具有祛風(fēng)除濕、消腫止痛之功效。廣西壯族民間將其用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛,肢體麻木,小兒麻痹癥后遺癥,跌打損傷[1]。小花青藤化學(xué)成分研究報(bào)道相當(dāng)少,僅在1991年報(bào)道其中6個(gè)生物堿成分[2],為豐富其化學(xué)成分,本實(shí)驗(yàn)從小花青藤乙酸乙酯提取物中分離鑒定了13個(gè)化合物,分別為香草酸(1)、丁香酸(2)、異香草酸(3)、肉桂酸(4)、1,2,4-苯三酚(5)、對羥基苯甲酸(6)、β-hydroxypropiovanillone (7)、原兒茶酸乙酯(8)、阿魏酸乙酯(9)、(+)-丁香脂素(10)、(6S,7E)-6-hydroxy-4,7-megastigmadien-3,9-dione(11)、Amygdalactone(12)和Wilsonol C(13)。上述化合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～13結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Bruker DRX-500(500MHz)核磁共振儀(Bruker,瑞士);UPLC-IT-TOF色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津制作所,日本);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Re-5298a,上海亞榮生化儀器廠);三用紫外儀(ZF-2,上海市安亭電子儀器廠);柱層析硅膠(200～300目)、薄層色譜所用硅膠(青島海洋化工廠);Rp-18(10～65μm)(Merck公司,德國);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(Pharmacia公司,瑞典);HPLC(Agilent公司,美國,型號:1260-II型);分析純甲醇(四川西隴科學(xué)有限公司);Fisher色譜級甲醇(Fisher,美國);TEDIA色譜級甲醇(TEDIA,美國);10%的硫酸-乙醇顯色劑;改良碘化鉍鉀顯色劑。

小花青藤于2019年6月采自荔浦縣瑤族蒲蘆鄉(xiāng),由中國科學(xué)院廣西壯族自治區(qū)廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為蓮葉桐科青藤屬(Illigera)小花青藤(I.parviflora)的干燥藤莖。標(biāo)本(編號tip-2019)保存于桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

2 提取與分離

取干燥小花青藤藤莖10kg,粉碎后用75%乙醇在室溫下浸提3次,每次3d,提取液合并,減壓濃縮至無乙醇味,濃縮液加入濃硫酸調(diào)節(jié)pH至2～3,過濾,濾液用等體積石油醚萃取3～4次,除去部分非生物堿成分;酸水層用氨水調(diào)節(jié)pH至7～8,用等體積乙酸乙酯萃取3～4次,乙酸乙酯層提取物為總堿(濃縮后80g)。總堿樣品用80g硅膠(80～100目)拌樣,800g硅膠(200～300目)裝柱,二氯甲烷-甲醇洗脫(1∶0～0∶1),TLC和改良碘化鉍鉀顯色劑進(jìn)行監(jiān)測,得到Ⅰ～Ⅵ組份。

I組份經(jīng)正相系統(tǒng)石油醚-乙酸乙酯(1∶0～0∶1)洗脫得I-1至I-20。I-10經(jīng)HPLC純化(55%甲醇/水)得到化合物4(6.6mg)和9(7mg),I-15經(jīng)HPLC純化(10%甲醇/水)得到化合物3(34.1mg),I-16經(jīng)HPLC純化(15%甲醇/水)得到化合物7(8.3mg)和11(6.8mg)。

II組份經(jīng)Rp-18,甲醇-水溶液梯度洗脫(10%～100%)得II-1至II-3。II-1經(jīng) LH-20過濾(甲醇)所得II-1-2經(jīng)HPLC純化(25%甲醇/水)得到化合物2(14mg),經(jīng)HPLC純化(10%甲醇/水)得到化合物1(11.8mg),II-1-4經(jīng)HPLC純化(5%甲醇/水)得到化合物8(9.3mg)和10(5mg)。

III組份經(jīng)Rp-18,甲醇-水溶液梯度洗脫(20%～100%)得III-1至III-10。III-1經(jīng)LH-20過濾(甲醇)所得III-1-1經(jīng)HPLC純化(15%甲醇/水)得到化合物12(5.4mg)和13(6.8mg)。

IV組份經(jīng)Rp-18,甲醇-水溶液梯度洗脫(20%～100%)得IV-1至IV-4。IV-1經(jīng) LH-20過濾(甲醇)所得IV-1-2經(jīng)HPLC純化(5%甲醇/水)得到化合物5(5.7mg)。

VI組份經(jīng)Rp-18,甲醇-水溶液梯度洗脫(20%～100%)得VI-1至VI-4。V-2經(jīng) LH-20過濾(甲醇)所得VI-2-1經(jīng)HPLC純化(5%甲醇/水)得到化合物6(5.2mg)。

3 結(jié)構(gòu)解析

化合物1:無色油狀,C8H8O4。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.58-7.46(2H,m,H-3,7),6.81(1H,d,J=8.0Hz,H-6),3.88(3H,s,4-OCH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC170.4(C-1),124.0(C-2),113.8(C-3),148.6(C-4),152.3(C-5),115.7(C-6),125.1(C-7),56.4(4-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]基本一致,故鑒定該化合物為香草酸。

化合物2:無色油狀,C9H10O5。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.32(2H,s,H-3,7),3.87(6H,s,4,6-OCH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC171.4(C-1),123.9(C-2),108.2(C-3,7),148.7(C-4,6),141.0(C-5),56.7(4,6-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]基本一致,故鑒定該化合物為丁香酸。

化合物3:無色油狀,C8H8O4。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.54(2H,d,J=10.0Hz,H-3,7),6.82(1H,d,J=8.0Hz,H-6),3.88(s,3H,5-OCH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC115.7(C-3),148.6(C-4),152.3(C-5),114.0(C-6),125.3(C-7),56.4(5-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]基本一致,故鑒定該化合物為異香草酸。

化合物4:無色油狀,C9H8O2。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.53-7.47(2H,m,H-2,6),7.36-7.25(3H,m,H-3,4,5),7.38(1H,d,J=16.0Hz,H-7),6.50(1H,d,J=16.0Hz,H-8);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC137.4(C-1),128.5(C-2,6),129.7(C-3,5),130.0(C-4),140.8(C-7),126.6(C-8),175.7(C-9)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致,故鑒定該化合物為肉桂酸。

化合物5:無色油狀,C6H6O3。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH6.78(1H,d,J=8.0Hz,H-2),7.45-7.38(2H,m,H-3,5);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC123.8(C-1),145.9(C-2),115.6(C-3,5),151.0(C-4),117.8(C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致,故鑒定該化合物為1,2,4-苯三酚。

化合物6:無色油狀,C7H6O3。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.86(2H,d,J=9.0Hz,H-3,7),6.80(2H,d,J=9.0Hz,H-4,6);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC170.8(C-1),123.5(C-2),132.9(C-3,7),115.9(C-4,6),163.1(C-5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致,故鑒定該化合物為對羥基苯甲酸。

化合物7:無色油狀,C10H12O4,ESI-MSm/z219[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.53(1H,d,J=2.0Hz,H-2),6.84(1H,d,J=8.0Hz,H-5),7.56(1H,dd,J=2.0,8.0Hz,H-6),3.14(2H,d,J=6.0Hz,H-8),3.93(2H,t,J=6.0Hz,H-9),3.89(3H,s,3-OCH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC130.3(C-1),111.8(C-2),149.2(C-3),153.9(C-4),115.9(C-5),124.8(C-6),199.7(C-7),41.6(C-8),58.9(C-9),56.3(3-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致,故鑒定該化合物為β-hydroxypropiovanillone。

化合物8:無色油狀,C9H10O4。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.44-7.37(2H,m,H-2,6),6.79(1H,d,J=8.0Hz,H-5),4.28(2H,q,J=7.0Hz,H-8),1.34(3H,t,J=7.0Hz,H-9);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC122.9(C-1),115.8(C-2),146.22(C-3),151.7(C-4),117.4(C-5),123.5(C-6),168.4(C-7),61.7(C-8),14.6(C-9)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致,故鑒定該化合物為原兒茶酸乙酯。

化合物9:無色油狀,C12H14O4,ESI-MSm/z245[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH7.17(1H,d,J=2.0Hz,H-2),6.80(1H,d,J=8.0Hz,H-5),7.05(1H,dd,J=2.0,8.0Hz,H-6),7.59(1H,d,J=16.0Hz,H-7),6.34(1H,d,J=16.0Hz,H-8),4.21(2H,q,J=7.0Hz,H-10),1.30(3H,t,J=7.0Hz,H-11),3.88(3H,s,3-OCH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC127.7(C-1),115.6(C-2),149.4(C-3),150.6(C-4),116.5(C-5),124.0(C-6),146.6(C-7),111.7(C-8),169.3(C-9),61.4(C-10),14.6(C-11),56.4(3-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致,故鑒定該化合物為阿魏酸乙酯。

化合物10:淺黃色粉末,C22H26O8,ESI-MSm/z457[M+K]+。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH6.65(4H,s,H-2,6,2′,6′),4.71(2H,d,J=4.0Hz,H-7,7′),3.19-3.10(2H,m,H-8,8′),4.33-4.20(2H,m,H-9a,9a′),3.88(2H,dd,J=4.0,9.0Hz,H-9b,9b′),3.84(12H,s,3,5,3′,5′-OCH3);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC133.1(C-1,C-1′),104.5(C-2,C-6,C-2′,C-6′),149.3(C-3,C-5,C-3′,C-5′),136.2(C-4,C-4′),87.6(C-7,C-7′),55.5(C-8,C-8′),72.8(C-9,C-9′),56.8(3,5,3′,5′-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致,故鑒定該化合物為(+)-丁香脂素。

化合物11:黃色油狀,C13H18O3,ESI-MSm/z443[2M-H]-。1H-NMR(CDCl3,500MHz)δH2.49(1H,d,J=17.0Hz,H-2a),2.33(1H,d,J=17.0Hz,H-2b),5.96-5.94(1H,m,H-4),6.82(1H,d,J=16.0Hz,H-7),6.46(1H,d,J=16.0Hz,H-8),2.30(3H,s,H-10),1.10(3H,s,H-11),1.01(3H,s,H-12),1.88(3H,d,J=1.5Hz,H-13);13C-NMR(CDCl3,125MHz)δC41.5(C-1),49.6(C-2),197.6(C-3),127.8(C-4),160.5(C-5),79.3(C-6),145.0(C-7),130.4(C-8),197.1(C-9),28.5(C-10),23.0(C-11),24.4(C-12),18.7(C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致,故鑒定該化合物為(6S,7E)-6-hydroxy-4,7-megastigmadien-3,9-dione。

化合物12:無色油狀,C15H20O6,ESI-MSm/z295[M-H]-。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH5.86(1H,s,H-3),7.81(1H,d,J=16.0Hz,H-5),6.24(1H,d,J=16.0Hz,H-6),1.94-1.81(2H,m,H-9a,11a),1.73(1H,dd,J=11.0,13.5Hz,H-9b),3.88-3.77(1H,m,H-10),2.25(1H,dd,J=1.5,7.0,14.0Hz,H-11b),1.99(3H,d,J=1.0Hz,H-13),1.06(3H,s,H-15),1.33(3H,s,H-16);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC173.7(C-2),126.9(C-3),143.1(C-4),134.2(C-5),128.7(C-6),82.9(C-7),53.4(C-8),40.9(C-9),65.3(C-10),42.3(C-11),90.0 (C-12),20.6(C-13),181.3(C-14),14.6(C-15),18.5(C-16)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致,故鑒定該化合物為Amygdalactone。

化合物13:無色油狀,C13H22O4,ESI-MSm/z265[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,500MHz)δH2.00(1H,dd,J=3.0,15.0Hz,H-2a),1.40-1.34(1H,m,H-2b),3.93(1H,q,J=3.0Hz,H-3),3.70-3.64(1H,m,H-4),2.37(1H,qd,J=3.0,7.0Hz,H-5),6.85(1H,d,J=16.0Hz,H-7),6.28(1H,d,J=16.0Hz,H-8),2.27(3H,s,H-10),1.19(3H,s,H-11),0.82(3H,s,H-12),0.98(3H,d,J=7.0Hz,H-13);13C-NMR(CD3OD,125MHz)δC39.6(C-1),38.1(C-2),72.0(C-3),76.4(C-4),32.2(C-5),81.7(C-6),153.0(C-7),131.2(C-8),201.1(C-9),27.4(C-10),27.3(C-11),26.8(C-12),13.3(C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致,故鑒定該化合物為Wilsonol C。

4 討論

小花青藤為廣西壯族民間用藥,其根莖為入藥部位,主要用于治療風(fēng)濕骨痛、小兒麻痹后遺癥,具有良好的開發(fā)潛力,但對其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)知之甚少。本研究豐富了小花青藤及青藤屬的化學(xué)成分,對闡釋該壯藥材民間用法提供理論依據(jù),為同屬植物資源的研究、開發(fā)和利用提供參考。