多基原藏藥普爾那抗炎活性成分比較研究

昂文索南,米 瑪,陳 靜

(西藏藏醫藥大學,西藏 拉薩 850000)

藏醫藥學作為我國傳統醫藥的重要組成部分,距今已有3 500多年歷史。經典古籍《四部醫典》中記載了大量藏藥材的性味功效、方劑配伍及使用禁忌等,對藏醫藥的傳承與發展具有重要的學術價值和指導意義。由于藏醫流派傳承、藥材生境差異及學者的認知不同,藏醫臨床對藥材的辨認及入方選用存在差異,出現了“一名多藥”即多基原現象。具有抗炎功效的常用藏藥普爾那就屬于多基原藥,即藏醫臨床既使用菊科植物結血蒿,也使用唇形科植物川藏香茶菜。普爾那(ArtemisiavestitaWall.ex Bess.)又稱普爾芒,系菊科植物結血蒿的地上部分,味苦、辛,氣臭,性寒,具有清熱解毒、消腫消炎、殺蟲利濕、止血等功效。興替那保(Rabdosiapseudo-irrorataC.Y.Wu)又名興托里那保、興替里、興替那布、興替納博等,系唇形科植物香茶菜的地上部分,味甘,消化后味苦,藏醫臨床用于消炎、去眼翳障等[1-3]。

其實自然界中存在很多具有消炎作用的化學物質。通過查閱文獻可知,苯丙素類、黃酮類化合物具有廣泛的生物活性,已知苯丙素類的綠原酸[4-6]、黃酮類的芹菜素[7-9]抗炎活性明顯。本研究采用高效液相色譜法,建立藏藥普爾那中綠原酸、芹菜素的含量測定方法,通過比較含量差異,提出藏醫臨床消炎所用最優藥材的選用建議,為藏藥材的臨床選擇、質量標準制訂提供數據支持。

1 藏藥普爾那抗炎活性成分文獻研究

通過查閱文獻資料發現,藏藥普爾那在藏醫臨床中常用于消炎止痛,對驅蟲與破傷風等細菌感染也有一定療效。臨床常用普爾那制劑匯總,見表1。

表1 普爾那相關成方制劑功效及用法

2 儀器與材料

高效液相色譜儀(E2695型,2485 型紫外檢測器,2998 型二極管陣列檢測器,WATERS公司);超聲波清洗機(SB 5200DT,寧波新芝生物技術股份有限公司);電子天平(ME204型,METTLER TOLEDO);粉碎機(A11 basic型,IKA公司)。

實驗用拉薩普爾那采自西藏拉薩奪底溝,康區普爾那購于西藏昌都。此2種藥材均經西藏自治區藥材鑒定專家嘠務教授鑒定確認,其中拉薩普爾那為結血蒿,康區普爾那為川藏香茶菜。

甲醇、乙腈為色譜純(進口),其他試劑均為分析純;超純水(MILLI-Q,ADVANTAGE A10);綠原酸對照品(CAS NO 327-97-9),成都康邦生物技術有限公司;芹菜素對照品(CAS NO 520-36-5),成都康邦生物技術有限公司;高效液相色譜儀(E2695型,2485 型紫外檢測器,WATERS公司);超聲波清洗機(SB 5200DT,寧波新芝生物技術股份有限公司);電子天平(ME204型,METTLER TOLEDO);粉碎機(A11 basic型,IKA公司)。

3 方法與結果

3.1 綠原酸測定方法與結果

3.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈-0.1% 磷酸水溶液(15∶85)為流動相;柱溫 30℃;流速為 1.0mL/min;檢測波長為 489nm;進樣量為 10μL;理論塔板數按綠原酸峰計算應不低于3 000。結果見圖1。

注:A.綠原酸對照品;B.結血蒿莖;C.結血蒿葉;D.川藏香茶菜莖;E.川藏香茶菜葉。

3.1.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸對照品0.002 0g,置于10mL 量瓶中,加甲醇定容,制成0.2mg/mL 溶液,作為對照品溶液儲備液。

3.1.3 供試品溶液的制備 取藥材適量,粉碎,取 1g 精密稱定,置于25mL 容量瓶中,加75% 乙醇,靜置過夜,80℃ 加熱超聲處理2h,放冷,加75% 乙醇至刻度,搖勻,經微孔濾膜(0.45μm)濾過,作為供試品溶液。

3.1.4 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液儲備液0.25、0.4、1、2、3、6、10mL 于比色管中,甲醇定容。標準系列綠原酸含量分別為5、8、20、40、60、120、200μg/mL。以峰面積為橫坐標、綠原酸含量(μg)為縱坐標,繪制標準曲線,計算得到回歸方程:Y=48 440X-65 244,R2=0.999 5,表明在5～200μg/mL 范圍內具有良好的線性關系。

3.1.5 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10μL,重復進樣7次,測得峰面積RSD=0.32%,表明系統有良好的精密度。

3.1.6 重復性實驗 精密稱取藥材粉末(過四號篩),按供試品溶液制備方法,平行制得7份供試品溶液后,測定,計算RSD=1.74%,表明本方法有良好的重復性。

3.1.7 穩定性實驗 取同一供試品溶液,分別于配置后 0、2、4、8、12、16、18h,注入高效液相色譜儀中,記錄峰面積,RSD=2.36%,表明供試品溶液在18h內穩定。

3.1.8 加樣回收實驗 精密稱取已測定含量的川藏香茶菜葉1.000 0g,稱定6份,分成3組,每組分別加入400μg/mL濃度的對照品溶液0.2、0.3、0.5mL,甲醇定容至25mL容量瓶中,按“3.1.3”項下條件制備加樣回收供試品溶液,并注入高效液相色譜儀中進行測定,計算平均回收率為91.26%,表明加樣回收效果較好。見表2。

3.1.9 樣品含量測定 按上述色譜條件對供試品溶液進行測定,測得藥材中綠原酸的含量。見表3。

表3 藏藥普爾那中綠原酸的含量 (μg/g)

3.2 芹菜素測定方法與結果

3.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);以甲醇-0.1%磷酸水溶液(60∶40)為流動相;柱溫30℃;流速為1.0mL/min;檢測波長為350nm;進樣量為10μL;理論塔板數按芹菜素峰計算應不低于3 000。結果見圖2。

3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜素對照品0.006 0g,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,制成0.6mg/mL溶液,作為對照品溶液儲備液。

3.2.3 供試品溶液的制備 同“3.1.3”項下操作。

3.2.4 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液儲備液0.025、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mL于比色管中,甲醇定容。標準系列芹菜素含量分別為1.5、6、12、18、24、30、60μg/mL。以峰面積為橫坐標,芹菜素含量(μg)為縱坐標,繪制標準曲線,計算得到回歸方程:Y=19 986X-5 571.9,R2=0.999 7,表明在1.5～60μg/mL范圍內具有良好的線性關系。

3.2.5 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10μL,重復進樣7次,測得峰面積RSD=0.61%,表明系統有良好的精密度。

注:A.芹菜素對照品;B.結血蒿莖;C.結血蒿葉;D.川藏香茶菜莖;E.川藏香茶菜葉。

3.2.6 重復性實驗 精密稱取藥材粉末(過四號篩)適量,按供試品溶液制備方法,平行制得7份供試品溶液后,測定,計算RSD=2.62%,表明本方法有良好的重復性。

3.2.7 穩定性實驗 取同一供試品溶液,分別于配置后0、2、4、6、11、15、20h,注入高效液相色譜儀中,記錄峰面積,RSD=2.99%,表明供試品溶液在20h內穩定。

3.2.8 加樣回收實驗 精密稱取已測定含量的川藏香茶菜葉1.000 0g,稱定6份,分成3組,每組分別加入濃度為0.3mg/mL的對照品溶液0.2、0.3、0.6mL,甲醇定容至25mL 容量瓶中,按“2.1.3”項下條件制備加樣回收供試品溶液,并注入高效液相色譜儀中測定,計算平均回收率為94.03%,表明加樣回收效果較好。

表4 芹菜素加樣回收率 (n=6)

3.2.9 樣品含量測定 按上述色譜條件對供試品溶液進行測定,測得藥材中芹菜素的含量。見表5。

表5 藏藥普爾那中芹菜素的含量 (μg/g)

4 討論

4.1 含量測定指標選擇

藏藥普爾那是臨床常用廣譜抗炎藥,近年來更被作為麝香的代用品入方劑使用。本研究在選擇含量測定指標時,重點考察了具有抗炎活性的化學成分。植物中的苯丙素類、黃酮類化合物具有廣泛生物活性。通過查閱文獻發現,已有大量關于綠原酸、芹菜素抗炎活性研究的文獻報道,故而選擇該2種化學成分作為多基原普爾那抗炎活性比較研究的含量測定對象。

綠原酸(chlorogenic acid)是苯丙素類化合物,具有較廣泛的消炎作用,已知具有抗炎[4-6]、抗菌[13]、抗腫瘤[14]、抗氧化[15-16]、提高免疫力[17]、減輕肺損傷[18-19]、緩解神經損傷[20]等多種生物活性。

芹菜素(apigenin)又稱芹黃素、洋芹素,是黃酮類化合物。國內外大量研究發現,芹菜素具有抗炎[7-9]、抗菌[21]、抗病毒[22]、抗腫瘤[23-24]、提高免疫力[25]、抗氧化[26]、治療糖尿病[27]等多種生物活性。

4.2 抗炎活性檢測結果

4.2.1 綠原酸含量 結血蒿中綠原酸的含量約為川藏香茶菜的19倍,其在莖中的含量為1 404.33μg/g,約為川藏香茶菜的16倍;在葉中的含量為1 338.61μg/g,約為川藏香茶菜的23倍;且此2種藥材莖中有效物質的含量均高于葉中的含量。

4.2.2 芹菜素含量 結血蒿葉中芹菜素的含量約為川藏香茶菜的200倍,其葉中的含量為1 040.24μg/g,是莖含量的8倍;川藏香茶菜莖中則未檢測出該成分。

4.2.3 抗炎活性分析 與川藏香茶菜相比,結血蒿中綠原酸、芹菜素的含量更高,推測其抗炎活性可能更好。該檢測結果與藏醫臨床用于消炎、殺蟲時多選用結血蒿,而治療眼疾則用川藏香茶菜的藥材選擇規律相符合。實驗發現,結血蒿莖、葉中的成分含量存在較大差異,即綠原酸的含量為莖多于葉,芹菜素的含量為葉多于莖。由于不同活性成分在同一藥材的不同藥用部位中的含量存在差異,這可能是結血蒿入藥部位為地上部分的原因。

多基原藏藥現象為藥材的入藥選擇、道地產地的確定帶來了難度,應深入開展藏藥材的質量標準研究,探究藏藥的活性成分和作用機制,為多基原藏藥的臨床選藥、合理用藥提供依據。