基于質(zhì)譜成像可視化表征甘草飲片主要化學(xué)成分組織分布

熊田田,羅世英,裴照卿,唐 策,3*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都 611137;2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院,四川 成都 611137;3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院,四川 成都 611137)

甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖,具有補(bǔ)脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1-2]。《神農(nóng)本草經(jīng)》將甘草列為上品,在中藥組方中常配伍使用,起到調(diào)和藥性的作用,素有“十方九草”之美譽(yù)。甘草主要包括甘草素等黃酮類、甘草酸等皂苷類、香豆素類、多糖類等成分,其中黃酮類和皂苷類含量較高[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,甘草具有抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)咳、抗抑郁等多種藥理活性。

甘草化學(xué)成分較多且成分復(fù)雜,目前關(guān)于甘草成分定性、定量分析研究主要為高效液相色譜(HPLC)、超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)、超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-QQQ-MS)等,質(zhì)量評(píng)價(jià)多側(cè)重于多個(gè)成分的含量測(cè)定。盡管甘草在植物化學(xué)和藥理作用等方面已有較多研究,但其在空間代謝物的報(bào)道還較少,因?yàn)椴捎蒙鲜龇椒ù蚍厶崛『?其空間代謝物相關(guān)信息被破壞或丟失。質(zhì)譜成像(Mass spectrometry Imaging,MSI)技術(shù)是一種基于質(zhì)譜分析,對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多點(diǎn)檢測(cè)、多維數(shù)據(jù)獲取及可視化,實(shí)現(xiàn)多分子水平、多分子種類、高靈敏度同時(shí)檢測(cè)并顯示其空間分布的分子成像技術(shù),不需要基質(zhì)涂抹的常壓原位電離質(zhì)譜分析技術(shù),可通過特定成像軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析,從而清晰直觀地反映出待測(cè)分子在天然藥物中的組織分布。質(zhì)譜成像技術(shù)既操作簡(jiǎn)便、又保證了被分析物的原位空間性和準(zhǔn)確性,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工業(yè)、食品、生物學(xué)等行業(yè)[4-6]。

本研究采用具有實(shí)時(shí)、在線、原位、高通量等特點(diǎn)的解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像(DESI-MSI)技術(shù),對(duì)甘草飲片中的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面的定性分析,對(duì)甘草根莖主要化學(xué)成分組織分布,進(jìn)行100μm的空間分辨率可視化表征,為甘草次生代謝產(chǎn)物的生物合成和積累提供重要信息。

1 儀器與試藥

Waters Snapt QTof質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);DESI-MSI質(zhì)譜成像系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司);移液槍(美國(guó)Thermo Scientific公司)。HPLC級(jí)甲醇(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),HPLC級(jí)甲酸(美國(guó)Thermo Fisher 公司),亮氨酸腦啡肽(美國(guó)Waters公司),Milli-Q純凈水。藥材收集于四川省成都市荷花池藥材市場(chǎng),經(jīng)唐策副教授鑒定為甘草GlycyrrhizaeRadixetRhizoma的根及根莖。

2 方法

2.1 供試品DESI-MSI分析

在具有解析電噴霧的SNAPT TOf質(zhì)譜儀上,掃描收集甘草的化學(xué)成分。通過高電壓加于N2輔助的電噴霧溶劑上形成帶電噴霧液滴,并直接噴射于樣品上,帶電溶劑與待分析物作用發(fā)生離子化,形成二次帶電液滴,在表面收集離子和中性分子,最后轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜檢測(cè)器創(chuàng)建質(zhì)譜圖像,并構(gòu)建2D圖像。使用高清晰度成像(HDI)軟件創(chuàng)建圖像,參數(shù)設(shè)置如下:X和Y像素大小為100μm;光柵速度300μm/s;噴霧溶劑由90%甲醇、10%水、0.05%甲酸和0.1mmol/L亮氨酸腦啡肽組成,溶劑流速為2μL/min,在負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜掃描,毛細(xì)管電壓4.5kV,錐孔電壓80V,m/z100-1 600。以產(chǎn)生原始MS文件創(chuàng)建MS圖像,LE(m/z554.2615)用于校正高分辨率。

2.2 數(shù)據(jù)處理

將MS原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入HDI V1.5軟件(美國(guó)Waters公司)查看圖像。通過數(shù)據(jù)庫(kù)查找有關(guān)甘草化學(xué)成分的文獻(xiàn)獲得有關(guān)成分化學(xué)名及分子式,運(yùn)用Mass Lynx V4.2(美國(guó)Waters公司)計(jì)算相對(duì)質(zhì)量及質(zhì)譜所得的離子碎片相對(duì)質(zhì)量與計(jì)算得出的相對(duì)質(zhì)量偏差進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

對(duì)鑒定出的甘草主要成分組織分布可視化圖像進(jìn)行分類歸納,其中,黃酮類22種、三萜類5種和其他類1種,甘草根莖組織橫切面分為皮層、韌皮部、形成層、木質(zhì)部、髓部5個(gè)部位,見表1和圖1。

表1 甘草主要化學(xué)成分

3.1 黃酮類成分在甘草橫切面的空間分布

對(duì)比分析甘草根莖中主要黃酮類成分的圖像,按如下方法鑒定了22種主要成分。m/z549.162 0經(jīng)過Mass Lynx V4.2軟件擬合得出分子式為C26H29O13,其中ppm為2.2,結(jié)合離子信號(hào)強(qiáng)度和所建成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)圖m/z549.162 0是成分芹糖甘草苷/芹糖異甘草苷(21)的組織分布圖,其余成分同理推測(cè)。

經(jīng)歸納總結(jié)出,甘草素/異甘草素(2)在形成層和髓部分布較多,韌皮部和木質(zhì)部次之;懷特酮/黃甘草異黃酮(8)、甘草異黃酮乙(11)、異甘草黃酮醇(12)、甘草香豆素(15)、新烏拉爾醇/烏拉爾醇(16)、Kanzonol(17)、甘草利酮(18)芹糖甘草苷/芹糖異甘草苷(21)主要分布在韌皮部和木質(zhì)部,在髓部幾乎無分布;高紫柳查爾酮(5)、紅車軸草素/異山柰素(6)、光甘草酮/異光甘草酮(7)、甘草查耳酮A/C/E/4′-O-甲基光甘草定(9)、Corylifol B(10)、3-羥基光甘草酚/脹果甘草寧A(19)分布不均勻;Angustone A/Isoangustone A(20)在髓部幾乎無分布,在皮層分布較多,其余部位分布均勻;異佛萊心苷(22)主要分布于韌皮部、木質(zhì)部、髓部,在形成層幾乎無分布。

成分熊竹素B(1)、三羥基異黃酮(3)、柚皮素查爾酮(4)、粗毛甘草素C(13)、Hirtellanine I(14)含量極少,離子信號(hào)較弱,為了使成分分布更清晰可觀,可以將最大信號(hào)強(qiáng)度再調(diào)小一些。

3.2 三萜類成分在甘草橫切面的空間分布

對(duì)比分析甘草根莖中主要三萜類成分的圖像,鑒定了5種主要成分。成分m/z821.398 4經(jīng)過Mass Lynx V4.2軟件擬合得出分子式為C42H61O16,其中,ppm為2.9,結(jié)合離子信號(hào)強(qiáng)度和所建成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)圖m/z821.398 4是成分甘草酸/烏拉爾甘草皂苷B/甘草皂苷H2/K2(24)的組織分布圖。成分甘草皂苷B2(23)、甘草酸/烏拉爾甘草皂苷B(24)、甘草皂苷J(rèn)2(25)、甘草皂苷G/羥基甘草酸(26)、甘草皂苷A3(27)主要分布在韌皮部和木質(zhì)部,形成層和髓部分布次之。

圖1 甘草主要化學(xué)成分成像

3.3 其他類成分甘草橫切面的空間分布

對(duì)比分析甘草根莖中主要其他類成分的圖像,鑒定了1種主要成分Glicophenone(28),其含量較少,在髓部幾乎沒有分布,其余部位分布不均勻。

4 討論

盡管DESI-MSI出現(xiàn)時(shí)間不長(zhǎng),但近年來其在植物成分分析方面的應(yīng)用證實(shí),DESI-MSI在植物成分空間分布的研究前景廣闊,如鉤藤三種生物堿分布研究,運(yùn)用此技術(shù)對(duì)不同生長(zhǎng)階段鉤吻植物不同部位的成分分布進(jìn)行成像分析[9];紅果樫木種子生物堿分布研究,運(yùn)用此技術(shù)對(duì)紅果樫木種子進(jìn)行成像分析,得出發(fā)育過程黃酮類生物堿積累的動(dòng)態(tài)規(guī)律[10];附子的成分分布研究,運(yùn)用此技術(shù)對(duì)附子生品和加工品進(jìn)行成像分析,得出不同蒸制時(shí)間點(diǎn)的化學(xué)成分分布規(guī)律[11]等。

甘草中成分復(fù)雜,其成分常含有大量同分異構(gòu)體,本研究?jī)H對(duì)樣本的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,同分異構(gòu)體對(duì)分析結(jié)果存在一定影響。部分成分在樣本上分布不均勻,影響了分析結(jié)果的直觀性,而LI等[12]對(duì)甘草質(zhì)譜成像的研究則證明質(zhì)譜成像技術(shù)在甘草根莖成分分布研究的可行性。

本研究運(yùn)用DESI-MSI技術(shù)對(duì)甘草根莖主要化學(xué)成分的空間分布進(jìn)行了研究,共鑒定出28種化學(xué)成分,并對(duì)其在皮部、髓部等不同微區(qū)的分布進(jìn)行了成像,得到了28種化學(xué)成分的組織分布情況。甘草黃酮類成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抑菌、保肝等作用,其治療心臟疾病、糖尿病等也具有一定藥用價(jià)值,近年來其更是在各類護(hù)膚品中有所應(yīng)用[13-14],甘草三萜類成分也有抗氧化作用[15]。不同成分對(duì)人體作用不同,各類成分在空間上的分布規(guī)律有利于目標(biāo)成分研究。對(duì)甘草根莖中成分的空間位置進(jìn)行成像研究,不僅有利于理解、掌握甘草中特定成分的分布規(guī)律和體內(nèi)生物合成,還可結(jié)合甘草代謝物在動(dòng)物組織切片中的分布,明確藥效成分及作用靶點(diǎn),亦可以對(duì)甘草炮制前后的成分變化進(jìn)行分析,找出增效減毒最大化的炮制方法。本研究為甘草主要化學(xué)成分空間分析提供了新信息,對(duì)豆科植物黃酮和皂苷的生物合成途徑研究可資借鑒,進(jìn)一步證明該技術(shù)可為植物中代謝物進(jìn)行高通量分析提供新方法,且DESI-MSI對(duì)甘草成分的空間成像分析,也為其他中藥材研究提供了參考和技術(shù)支撐,應(yīng)用前景廣闊。