耐酸、抗氧化型槲皮素高效腸道靶向遞送體系的構建及其性能

張 越, 沈 文, 羅廣文, 徐靜文

(陜西科技大學 食品科學與工程學院(生物與醫(yī)藥學院), 陜西 西安 710021)

0 引言

多酚是植物體內的復雜酚類次生代謝物,具有多元酚結構,主要存在于植物的皮、根、葉和果肉中,含量僅次于纖維素、半纖維素和木質素,其多元酚結構具有獨特的理化性質,如能與蛋白質、生物堿、多糖等結合,能與金屬離子絡合,具有還原性、捕捉自由基的活性和諸多衍生化反應活性等,因而廣泛應用于農業(yè)、生態(tài)環(huán)境、食品、醫(yī)藥等領域[1].

槲皮素作為一種重要的多酚類化合物,具有抗高血壓、抗糖尿病、抗哮喘、抗癌、抗病毒和抗氧化等藥理活性[2],但其自身的平面型分子結構導致其親水性及親脂性差、化學穩(wěn)定性差、生物利用率低,限制了其在食品、醫(yī)藥等方面的應用.目前,基于提高槲皮素穩(wěn)定性和生物利用率的口服遞送體系很多,如槲皮素納米膠束[3]、槲皮素納米粒[4]等,這些遞送體系對槲皮素提供了初步保護,在一定程度上提高了槲皮素的穩(wěn)定性及生物利用度,但依舊存在一些問題,例如:

(1)傳統(tǒng)口服遞送體系大多通過氫鍵、電荷作用等非共價鍵與槲皮素相結合[5],因非共價作用易受胃腸道的酸性環(huán)境及其含有的離子等影響,因此體系的穩(wěn)定性很不理想;(2)傳統(tǒng)載體大多不耐酸,在胃腸液中穩(wěn)定性差,滯留時間較短,難以實現(xiàn)高效腸靶向遞送;(3)已有研究表明,腸道炎癥發(fā)生時,會大量分泌ROS[6],而ROS大概率會將槲皮素氧化成醌失效,因此槲皮素在腸道釋放后是否依舊具有活性尚未可知.目前亟待構建耐酸,抗氧化型槲皮素高效腸道靶向遞送體系.

魔芋葡甘聚糖(KGM)是一類由植物魔芋塊根中萃取出的水溶性多糖,是目前所知道的黏度最高的一類植物多糖,具有抗氧化、提高免疫力、改善血糖、血脂水平等多種功效[7].因KGM在體內可降解且具有良好的生物相容性,近年來被越來越多地用作藥物載體[8-10].

據報道,巰基化載體可以通過與腸黏液中黏蛋白上的巰基形成二硫鍵而實現(xiàn)腸道黏附[11],含硒化合物可以提高體內谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的水平,防止自由基的積累,進而發(fā)揮ROS清除的功能[12].基于此,本研究采用硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)和巰基化海藻酸鈉(TSA)為原料,乳酸鈣為交聯(lián)劑,構建了一種耐酸、ROS自清除型槲皮素口服腸道靶向遞送體系,為槲皮素等多酚營養(yǎng)素的高效腸道靶向遞送提供了新的思路.

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

槲皮素(96%,上海賢鼎生物科技有限公司);魔芋葡甘聚糖(90%,深圳盛海生物工程有限公司);海藻酸鈉(黏度200±20 mPa·s,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);巰基乙醇酸(90%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乳酸鈣(98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);黏蛋白(豬胃黏膜素,BR,上海麥克林生化科技公司);硫酸亞鐵(90%,上海麥克林生化科技公司);水楊酸(99.5%,上海麥克林生化科技公司);無水乙醇(天津科密歐化學試劑有限公司).

1.2 儀器與設備

Multiskan SkyHigh全波長酶標儀(賽默飛);VECTOR-22傅里葉變化紅外光譜儀(德國布魯克);激光粒度Zeta電位儀(奧地利安東帕);FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN 透射電子顯微鏡(美國FEI);KH5200DE型數控超聲波清洗器(昆山禾制超聲儀器有限公司).

1.3 Ca2+交聯(lián)耐酸、耐氧化的槲皮素載體的構建

1.3.1 硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)的制備

稱取0.50 g魔芋葡甘聚糖(KGM)將其溶于50 ml 0.5%(v/v)硝酸溶液中,充分溶解后加入0.86 g Na2SeO3和0.61 g BaCl2,混勻后置于60 ℃中反應8 h,冷卻至室溫后向反應液中加入0.50 g無水硫酸鈉攪拌均勻,產生白色沉淀;將該懸濁液離心后取上清液,加入碳酸氫鈉使其中和至中性后加入足量乙醇產生白色沉淀,經離心棄去上清液,將沉淀在50 ℃下真空干燥3 h,得到最終產物[12].(產率:36.4%)

1.3.2 巰基化海藻酸鈉(TSA)的制備

將1.00 g海藻酸鈉(SA)加入到20 mL水中溶解為均質溶液,向該溶液中緩慢加入1.30 mL巰基乙醇酸;并將1 mL濃度為10 M的鹽酸逐滴加入至反應液使其酸化后置于60 ℃中反應3 h.反應完成后將其緩慢加入足量甲醇產生白色沉淀,離心后棄去上清液得到產物(產率:50.8%)[13].

1.3.3 鈣離子交聯(lián)硒化魔芋葡甘聚糖-巰基化海藻酸鈉(SeKGM-TSA/Ca2+)微凝膠的制備

將1 mL的SeKGM溶液緩慢加入3.5 mL的TSA溶液中,混合均勻后室溫攪拌12 h,后將1 mL上述混合液逐滴加入到12 mL乳酸鈣溶液中,滴加完畢后繼續(xù)攪拌5 h,離心后取其上清液,即為SeKGM-TSA/Ca2+微凝膠.

1.3.4 負載槲皮素的鈣離子交聯(lián)硒化魔芋葡甘聚糖-巰基化海藻酸鈉(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)微凝膠的制備

取槲皮素溶液(1 mL)加入至3.5 mL的TSA溶液中,混合均勻后向其中加入1 mL SeKGM溶液,混合均勻后將其置于室溫下攪拌12 h后將1 mL上述混合液逐滴加入12 mL乳酸鈣溶液中,滴加完畢后室溫下攪拌5 h,離心后取其上清液,冷凍干燥后即得SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠.

1.4 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的結構表征

采用傅里葉紅外光譜(FT-IR)來確證微凝膠的成功制備,采用透射電子顯微鏡(TEM)和激光粒度Zeta電位儀觀察微凝膠的微觀形態(tài)和Zeta電位(ζ).

1.5 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠包載行為研究

1.5.1 槲皮素標準曲線的測定

將槲皮素置于容量瓶中,配制成濃度范圍在1～15 μg mL-1的標準曲線,在374 nm處測定其吸光度,對槲皮素標準溶液的紫外吸光度(A)和濃度(C)進行線性擬合,得到如公式(1)所示的標準曲線:

(1)

1.5.2 SeKGM-TSA/Ca2+@Q對槲皮素的包載行為

取適量SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠凍干粉末研碎后,將其溶于10 mL水中,以40 W的頻率超聲30 min進行破壁.結束后取1 mL超聲液置于10 mL容量瓶中,用50%乙醇溶液定容.用酶標儀測定稀釋液在374 nm處的吸光度.按照式(2)計算微凝膠的載藥量,式(3)計算微凝膠包封率:

(2)

(3)

式(2)、(3)中:We表示包封于微凝膠中的槲皮素質量,Wm表示微凝膠的總質量,W為體系中加入的槲皮素總量.

1.6 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對·OH的清除效果測定

體外模擬胃腸道消化產物的制備:將負載有槲皮素的微凝膠(3 mg·mL-1)溶解在模擬胃液中(胃蛋白酶3.2%,NaCl 2%,濃鹽酸調節(jié)pH至1.2),37 ℃下100 rpm攪拌2 h后用1M NaOH調節(jié)pH至7.4,加入等比例胰蛋白酶繼續(xù)攪拌4 h,即得.

采用Fenton試劑法[14]分別檢測①槲皮素(Q)、②TSA、③SeKGM、④TSA-SeKGM/Ca2+、⑤TSA-SeKGM/Ca2+@Q和⑥體外模擬胃腸道消化載藥微凝膠(Digested products)對·OH的清除效果.將槲皮素(Q)、TSA、SeKGM、TSA-SeKGM/Ca2+、TSA-SeKGM/Ca2+@Q、體外模擬胃腸道消化載藥微凝膠(Digested products)均配制成濃度為3 mg·mL-1的樣品溶液.將9 mM硫酸亞鐵溶液(50 μL)、9 mM水楊酸-乙醇溶液(50 μL)和樣品溶液(50 μL)置于96孔板中混合均勻后,加入50 μL 8.8 mM過氧化氫溶液啟動反應,在37 ℃下反應0.5 h后測定其在510 nm波長處的吸光度.該實驗陽性對照組為抗壞血酸(VC),空白對照組為蒸餾水,按式(4)計算樣品對·OH的清除率:

(4)

式(4)中:A0為蒸餾水空白對照組的吸光度,AS為樣品的吸光度,AC為等體積水楊酸-乙醇溶液代替硫酸亞鐵溶液作為試劑的對照組.

1.7 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠腸道黏附行為研究

將黏蛋白溶解在三種不同pH值的等滲緩沖液中,濃度為0.2%(w/v)(pH 2.0、pH 6.8 和 pH 7.4).將SeKGM-TSA/Ca2+、SeKGM-TSA/Ca2+@Q以3 mg mL-1的濃度分散在上述黏蛋白緩沖溶液中,在37 ℃下振蕩2 h.隨后,將溶液以12 000 rpm的轉速離心2 min,采用高碘酸希夫(PAS)比色法測量上清液中未結合的黏蛋白.同法測量黏蛋白標準品(0.01～2.5 mg mL-1)制備黏蛋白標準校準曲線.與樣品結合的黏蛋白量(mg)為添加的黏蛋白總量與游離黏蛋白量之間的差值.

1.8 體外釋放

以400 mL的模擬胃液/腸液作為體外釋放介質.將60 mg的SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠復溶于5 mL的去離子水中,將其置于透析袋中,首先將其置于pH=2.0的磷酸鹽緩沖液(人工胃液)中釋放2 h,每隔1 h取一次樣;后將透析袋迅速取出,置于pH=6.8的磷酸鹽緩沖液(人工腸液)中釋放3 h,每隔1 h取一次樣;最后在pH=7.4的磷酸鹽緩沖液(人工結腸液)中釋放3 h,每隔30 min取一次樣.每次取樣時,補充同體積等pH釋放介質.取樣完成后,用50%的乙醇萃取游離槲皮素,并用酶標儀測定其在374 nm處的吸光度,按照式(5)計算各時間點累積釋藥率,并繪制SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的釋放曲線:

(5)

式(5)中:MT、MZ分別代表在第T小時釋放出槲皮素的質量和釋放開始時水凝膠中槲皮素的總量.

2 結果與討論

2.1 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的表征

2.1.1 紅外光譜

巰基海藻酸鈉(TSA)、硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)、槲皮素(Q)和負載槲皮素的微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)的紅外譜圖如圖1所示.

圖1 SeKGM-TSA/Ca2+@Q、Q、SeKGM和TSA的傅里葉變換紅外光譜圖

海藻酸鈉在巰基化后在2 668 cm-1處出現(xiàn)了巰基特征峰,表明巰基海藻酸鈉已成功合成.魔芋葡甘聚糖在硒化后753 cm-1出現(xiàn)了亞硒酸酯的特征峰,說明硒化魔芋葡甘聚糖的形成.3 303 cm-1為槲皮素酚羥基特征振動峰,1 671 cm-1為α,β-不飽和脂肪酮的酮羰基的特征振動峰.當與乳酸鈣交聯(lián)后,C-H在2 895 cm-1和2 983 cm-1處的對稱和非對稱伸縮振動強度減弱,并且,在1 734～1 130 cm-1區(qū)域出現(xiàn)的所有峰都向低波數區(qū)域移動,峰的強度減弱是空間效應的結果,表明乳酸鈣與TSA與SeKGM成功交聯(lián),蛋殼結構形成,槲皮素成功負載.

2.1.2 粒徑與Zeta電位

激光粒度Zeta電位儀測定結果如圖2(a)所示,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的流體力學直徑(Dh)為211.7±3.03 nm,多分散指數(PDI)為0.167±0.009,粒度分布呈現(xiàn)單峰,表明微凝膠分布均勻.Zeta電位測定結果如圖2(b)所示,TSA和SeKGM的Zeta電位分別為-22.3±1.7 mV、-10.8±0.9 mV,槲皮素自身基本不帶電,且空白微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+)與負載槲皮素后的微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)相比,電位變化不大,可間接證明槲皮素已被成功負載.

圖2 微凝膠及其中間體的粒徑分布及zeta電位

2.1.3 透射電鏡

透射電鏡觀察結果如圖3所示.結果表明,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠為球狀、分布均勻的球形,直徑為88.8±13.56 nm.說明該微凝膠可穿透腸道黏液層[15].

圖3 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的透射電鏡圖

2.2 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對槲皮素的包載行為分析

SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對槲皮素包載行為測定的結果表明,微凝膠平均載藥率為5.24%,包封率為80.46%,表明SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對槲皮素的負載能力良好[16].

2.3 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對·OH的清除效果

由圖4可知,游離槲皮素(Q)、巰基化海藻酸鈉(TSA)和硒化魔芋葡甘聚糖(SeKGM)對·OH的清除率分別為19.3%±1.79%、37.8%±0.85%和33.1%±1.09%,空白微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+)對·OH的清除率為43.0%±1.58%,表明該體系具有自主ROS清除效果.負載槲皮素后的微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)對·OH的清除率可達50.2%±1.12%,與游離槲皮素相比,·OH清除能力顯著提高.除此之外,微凝膠經體外模擬胃腸液消化后,·OH清除率仍高達80.8±0.96%,為實現(xiàn)槲皮素的穩(wěn)定腸靶向遞送提供了結構基礎.

2.4 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的腸道黏附性能

在pH 2.0、6.8和7.4的條件下,通過對黏蛋白的體外黏附來評估微凝膠的黏附行為,結果如圖5所示.空白凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+)在pH 2.0、6.8、7.4下黏蛋白的黏附量分別為74.3±0.79 mg、111.9±0.20 mg、141.0±0.46 mg;負載槲皮素后的微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)在pH 2.0、6.8、7.4下黏蛋白的黏附量分別為94.1±0.37 mg、145.6±0.79 mg、162.0±0.53 mg.結果表明,微凝膠對黏蛋白有良好的黏附效果,這是由于巰基可以與腸黏液中黏蛋白的巰基形成二硫鍵,從而使微凝膠在腸道中的作用時間延長.并且,負載有槲皮素的微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)對黏蛋白的黏附效果更好,這可能是因為其表面的槲皮素與黏液存在氫鍵和靜電作用.

圖4 Q、TSA、SeKGM、SeKGM-TSA/Ca2+和SeKGM-TSA/Ca2+@Q、體外模擬胃腸道消化載藥微凝膠(Digested products)對·OH的清除效果

圖5 SeKGM-TSA/Ca2+和SeKGM-TSA/Ca2+@Q對黏蛋白的黏附能力

2.5 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的體外釋放

采用透析法測定SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠在不同pH下的體外釋藥行為.結果如圖6所示,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠在模擬胃液(pH=2.0)和模擬腸液(pH=6.8)中5 h累計釋放量小于15%,而在模擬結腸液(pH=7.4)中迅速釋放,最終累計釋放量為56.7%±1.47%.結果表明,該微凝膠在胃腸部位對槲皮素具有良好的保護作用;當微凝膠進入結腸后,表面的鈣交聯(lián)層逐漸瓦解,最終完成槲皮素的結腸靶向釋放.

圖6 SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠的體外釋放曲線

3 結論

本文制備了一種耐酸、ROS自主清除型微凝膠(SeKGM-TSA/Ca2+@Q)用于槲皮素的高效腸道靶向遞送.經FT-IR證實,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠成功制備,且透射電子顯微鏡呈現(xiàn)出粒徑為88.8±13.56 nm的球狀結構,所構建的SeKGM-TSA/Ca2+、SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對·OH的清除率分別為43.0%±1.58%和50.2%±1.12%,具有顯著的ROS自主清除能力.此外,SeKGM-TSA/Ca2+@Q微凝膠對黏蛋白有很好的黏附能力,體外釋放實驗表明該體系可保護槲皮素免被胃酸破壞,最終槲皮素的腸靶向釋放累積量為56.7%±1.47%.綜上所述,該耐酸、ROS自清除型微凝膠可保護槲皮素免被胃酸腐蝕和胃腸道ROS氧化失效,實現(xiàn)槲皮素的高效腸道靶向遞送.