蘋果酵素的制備及其抗氧化功能研究

王虎玄, 柯西娜, 王 聰, 朱亞南, 孫宏民

(陜西科技大學 食品科學與工程學院, 陜西 西安 710021)

0 引言

自由基對人體健康具有較大負面影響.老年癡呆、動脈硬化、心腦血管疾病、糖尿病等多種慢性疾病的發生和發展,以及人體衰老均與體內自由基密切相關[1,2].大量自由基等氧化物負面影響蛋白質、DNA等胞內生物活性大分子的結構和功能,從而引發人體機能紊亂,產生病變.研究表明經常食用具有抗氧化功能的食品對預防和緩解由自由基引發的疾病具有良好的效果.因此,開發具有良好抗氧化活性的功能食品已成為國內外學者的研究熱點[3,4].

植物酵素是以水果、蔬菜、谷物等為原料,通過微生物(乳酸菌、酵母、霉菌)發酵制備的富含生物活性成分(酶、維生素、礦物質以及次生代謝產物等)的新型功能性產品[5].植物酵素含有多種功能酶,如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶(SOD)等;含有多種抗氧化類物質,如多酚類化合物、氨基丁酸等;含有多種風味物質,如芳香類化合物、多糖等;并含有其它活性物質,如功能多肽等[6].上述功能營養成分在植物酵素維持和保護人體健康方面發揮了重要作用.研究發現,植物酵素在抗氧化、清除自由基、活化細胞、平衡內分泌、提高身體免疫、美容養顏等方面具有良好功效,能預防和緩解多種急慢性疾病的發生和發展[7,8].人體細胞雖可合成少量酵素,但仍需通過日常膳食吸收補充才能使體內酵素實現動態均衡.體內酵素缺乏,可導致自由基氧化損傷、新陳代謝受阻等機體功能紊亂,從而產生急慢性病癥[9].因此,植物酵素食品已成為風靡日本、歐洲等國家和地區的“明星”保健食品.我國也于2019年將食用酵素列為《產業結構調整指導目錄》鼓勵類產業.

蘋果屬薔薇科蘋果亞科,不僅富含多酚、類黃酮、膳食纖維、維生素等多種功能營養物質,而且具有抗氧化、抗癌、預防心血管及其它慢性疾病等作用.蘋果是我國種植面積較廣的農業資源,尤其在秦嶺以北陜西寶雞、咸陽、延安等地區分布廣泛,已經作為支柱產業發展.總種植面積已超過1 000萬畝,年產量在1 200萬噸左右,資源十分豐富.目前,陜西蘋果產業規模和產量穩居全國首位,已成為陜西農業的特色優勢產業,也是鄉村振興的主導產業.雖然陜西蘋果資源非常豐富,但開發利用狀況相對落后,加工種類單一(主要是蘋果濃縮汁),產值偏低,經濟效益有限.蘋果精深加工技術的落后,直接制約著高附加值產品的生產.為了破除上述產業弊端,并契合“面向人民生命健康”的產業發展趨勢,以蘋果為原料進行酵素生產具有良好的資源優勢和開發價值.目前關于蘋果酵素開發的研究已有報道,但大多采用單一菌種進行發酵[10,11].同時采用不同菌種組合發酵(如酵母菌+乳酸菌組合發酵)可以利用微生物之間互利共生關系而生成更豐富的代謝產物(如蘋果中糖類物質作為碳源被酵母菌發酵利用,而其它組分可通過酵母菌代謝生成次生產物,如SOD前體物;進一步通過乳酸菌發酵可促進蘋果酚類化合物形態轉化等),克服單一菌種發酵不足的缺點,從而制備出具有更好生理活性的酵素,但這方面的報道較少[12,13].

本文以陜西洛川富士蘋果為原料,以酵母菌和乳酸菌為發酵菌種,以SOD活力、總酸含量為主要指標,采用組合發酵方式,對影響酵母菌和乳酸菌發酵的工藝參數進行了優化,明確了蘋果酵素發酵的最佳工藝條件,并對蘋果酵素的抗氧化功能進行了初步分析.研究結果可為基于組合發酵改善蘋果營養價值和功能特性提供理論支撐,也為高附加值蘋果精深加工產品的開發提供技術支撐,經濟效益和應用價值顯著.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要材料

洛川富士蘋果:選取大小均一、無病蟲害、無機械損傷、成熟度相近、色澤一致的果實,蘋果購買于西安本地超市;釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌:均為食品級,由陜西科技大學食品科學與工程學院實驗室提供.

1.1.2 主要試劑

酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、MRS肉湯培養基,購自北京奧博星生物技術有限公司;纖維素酶、果膠酶,購自上海源葉生物科技有限公司;NaOH、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、D-山梨醇、蔗糖、 濃鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸亞鐵、福林酚等,均為分析純,購自天津科密歐化學試劑有限公司;SOD試劑盒,購自上海碧云天生物技術有限公司.

1.2 主要儀器

SP-756P紫外可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司;TDZ5-WS臺式離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;PXY-DHS-500BS恒溫培養箱,上海躍進醫療器械廠;SW-CJ-1F超凈工作臺,蘇凈集團-蘇州安泰空氣技術有限公司;pHS-25pH計,上海儀電科學儀器集團.

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果酵素制備工藝流程

新鮮蘋果→切塊勻漿→酶解→過濾→滅菌→調配→接種酵母菌→恒溫發酵→接種乳酸菌→恒溫發酵→4 ℃冷藏→蘋果酵素

1.3.2 操作要點

(1)原料預處理

清水洗凈蘋果后去核、切塊,打漿,然后添加復合酶制劑(果膠酶與纖維素酶比例3∶1)進行酶解.復合酶制劑添加量為0.05% w/v,酶解溫度為55 ℃,酶解時間為2 h,潔凈紗布過濾,濾汁高溫滅菌處理[14].

(2)酵母菌活化

用適量無菌生理鹽水溶解釀酒酵母菌粉,然后將菌液涂布于YPD固體培養基,并將培養基置于28 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d.挑取單菌落再次接種于10 mL YPD液體培養基中,并將液體培養基置于搖床(28 ℃,200 r/min)中培養24 h.

(3)酵母菌接種

取適量酵母菌菌液離心去上清,加入等量無菌生理鹽水,然后接種至蘋果汁(接種量1% v/v)中,28 ℃發酵20 h,定期通風以保證充分溶氧.

(4)乳酸菌活化

將鼠李糖乳桿菌與植物乳桿菌凍存液分別接種于適量MRS液體培養基中,并將液體培養基置于搖床(37 ℃,200 r/min)中培養12 h.吸取適量培養液再次接種于MRS液體培養基中培養12 h (接種量1% v/v).

(5)乳酸菌接種

取適量乳酸菌菌液離心去上清,加入等量無菌生理鹽水,然后接種至已被酵母菌發酵20 h的蘋果汁中(接種量1% v/v),37 ℃發酵20 h.

1.3.3 蘋果酵素酵母菌發酵工藝優化

相對于酵母菌而言,乳酸菌更能快速有效地利用營養物質,因此在蘋果酵素制備過程中,首先采用酵母菌發酵,然后進行乳酸菌發酵[15].

(1)發酵溫度的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,蘋果汁起始pH為4.0,酵母菌接種量為1% v/v,發酵時間為20 h,調節發酵溫度分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃進行發酵.發酵結束后測定蘋果發酵液SOD活性,以確定最適的酵母菌發酵溫度.

(2)發酵時間的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,蘋果汁起始pH為4.0,發酵溫度為30 ℃,酵母菌接種量為1% v/v,調節發酵時間分別為10 h、15 h、20 h、25 h、30 h進行發酵.發酵結束后測定蘋果發酵液SOD活性,以確定最適的發酵時間.

(3)接種量的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,蘋果汁起始pH為4.0,發酵溫度為30 ℃,發酵時間為20 h,調節酵母菌接種量分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5% v/v進行發酵.發酵結束后測定蘋果發酵液SOD活性,以確定最適的酵母菌接種量.

(4)蔗糖添加量的考察

固定蘋果汁起始pH為4.0,發酵溫度為30 ℃,酵母菌接種量為1% v/v,發酵時間為20 h,調節蘋果汁中蔗糖添加量分別為4%、5%、6%、7%、8% w/v進行發酵.發酵結束后測定蘋果發酵液SOD活性,以確定最適的蔗糖添加量.

(5)蘋果汁起始pH的考察

固定蘋果汁中蔗糖添加量為6% w/v,發酵溫度為30 ℃,酵母菌接種量為1% v/v,發酵時間為20 h,調節蘋果汁起始pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0進行發酵.發酵結束后測定蘋果發酵液SOD活性,以確定最適的蘋果汁起始pH.

(6)蘋果酵素酵母菌發酵響應面試驗設計

基于單因素實驗結果,選取發酵時間、發酵溫度、蘋果汁起始pH和蔗糖添加量四個因素,以SOD活力為響應值,進行四因素三水平的Box-Benhnken試驗設計,研究蘋果酵素酵母菌發酵的最優工藝參數.

1.3.4 蘋果酵素乳酸菌發酵工藝優化

在酵母菌發酵一定時間后,蘋果汁發酵液SOD活力達到最高時,分別接種鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌,進行乳酸菌發酵.

(1)發酵溫度的考察

調節蘋果發酵液pH為5.0,固定乳酸菌接種量為1% v/v,發酵時間為20 h,調節發酵溫度分別為28 ℃、33 ℃、37 ℃、41 ℃、46 ℃進行發酵,發酵結束后測定蘋果發酵液中乳酸菌數量和總酸含量,以確定乳酸菌的最適發酵溫度.

(2)發酵時間的考察

調節蘋果發酵液pH為5.0,固定乳酸菌接種量為1% v/v,發酵溫度為37 ℃,調節發酵時間分別為10 h、15 h、20 h、25 h、30 h進行發酵,發酵結束后測定蘋果發酵液中乳酸菌數量和總酸含量,以確定乳酸菌的最適發酵時間.

(3)接種量的考察

調節蘋果發酵液pH為5.0,固定發酵溫度為37 ℃,發酵時間為20 h,調節乳酸菌接種量分別為0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5% v/v進行發酵,發酵結束后測定蘋果發酵液中乳酸菌數量和總酸含量,以確定乳酸菌的最適接種量.

(4)蘋果發酵液起始pH的考察

固定乳酸菌接種量為1% v/v,發酵溫度為37 ℃,發酵時間為20 h,調節蘋果發酵液起始pH分別為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9進行發酵,發酵結束后測定蘋果發酵液中乳酸菌數量和總酸含量,以確定蘋果發酵液的最適起始pH.

(5)蘋果酵素乳酸菌發酵響應面試驗設計

基于單因素實驗結果,篩選發酵性能優良的乳酸菌進行響應面優化設計.選取發酵時間、發酵溫度、蘋果發酵汁起始pH三個因素,以發酵液總酸含量為響應值,進行三因素三水平的Box-Benhnken試驗設計,研究蘋果酵素乳酸菌發酵的最優工藝條件.

1.3.5 相關指標測定方法

(1)SOD活力

參考GB/T 5009.171-2003[16],使用SOD活力試劑盒(NBT法)進行檢測.具體測定方法見試劑盒操作說明書.

(2)總酸含量

參考GB/T 12293-2021[17]中的方法測定.

(3)酵母菌濃度

采用血球計數板法測定.

(4)乳酸菌濃度

參考GB/T 4789.35-2016[18]采用MRS培養基進行平板接種計數,計算乳酸菌濃度.

(5)抗氧化性指標的測定

羥基自由基清除率、鐵離子還原力以及總酚含量參考相關文獻[19,20]中的方法進行測定.

1.3.6 數據處理

所有試驗均進行3次重復,試驗數據以均值±標準差表示.采用SPSS 12.0軟件對試驗數據進行方差分析+多重比較檢驗(p<0.05,Duncan′s-multiple-range-test)或者t檢驗(p<0.05).

2 結果與討論

2.1 蘋果酵素酵母菌發酵工藝優化結果

2.1.1 發酵溫度的考察

隨著菌種的不同,酵母菌最適生長溫度一般介于20 ℃～30 ℃[21].從圖1(a)可以看出,發酵溫度為20 ℃時,可能溫度過低導致本文所用的酵母菌株代謝速率減弱,因而發酵液SOD活力較低.隨著發酵溫度升高,酵母菌株代謝速率逐步加快,發酵液SOD活力隨之逐漸增加.發酵溫度達到30 ℃時,發酵液SOD活力達到峰值(143.07±2.01 U/mL).隨著發酵溫度進一步升高(達到35 ℃和40 ℃時),可能過高溫度對酵母菌株代謝活性產生抑制作用,導致發酵液SOD活力快速降低.因此蘋果酵素酵母菌發酵溫度控制在30 ℃左右進行響應面試驗.

2.1.2 發酵時間的考察

從圖1(b)可以看出,隨著發酵時間的延長,發酵液SOD活力呈現出先快速增加而后逐漸下降的趨勢.發酵20～25 h后,酵母菌株可能已經充分代謝蘋果汁中碳源物質生成SOD,SOD生成量達到峰值,因而發酵液SOD活力達到峰值(134.21±3.53 U/mL).隨著發酵時間進一步延長(達到30 h時),發酵液SOD活力逐漸下降.這可能是由于SOD作為一類金屬酶(含有Cu、Zn、Fe或Mn金屬離子等作為輔基),酵母長時間代謝產生的過量Mn、Fe等金屬離子對SOD活性產生抑制作用[22].因此蘋果酵素酵母菌發酵時間控制在20 h左右進行響應面試驗.

2.1.3 酵母菌接種量的考察

從圖1(c)可以看出,隨著酵母菌接種量的增加,發酵液SOD活力呈現出先快速增加而后緩慢下降的趨勢.接種量介于0.5%～1.0% v/v時,隨著接種量的增加,酵母菌代謝速率快速加大,因而發酵液SOD活力隨之快速增加.接種量達到1.0% v/v時,發酵液SOD活力達到峰值(128.53±3.28 U/mL).接種量超過1.0% v/v后,發酵液SOD活力緩慢下降.這可能是由于接種量過高導致發酵液中酵母菌濃度大幅增加,蘋果汁中有限含量的碳源等營養成分無法支撐酵母菌充分代謝,引發酵母菌株間對營養成分的爭奪,酵母菌代謝活性受到抑制[23].此外,過高接種量可能引發酵母菌出現菌體自溶,活菌濃度降低導致代謝能力減弱,從而導致SOD活力降低[24].因此蘋果酵素酵母菌發酵接種量控制在1.0% v/v為宜.

2.1.4 蔗糖添加量的考察

酵母菌的發酵特性與底物濃度、溫度、pH等密切相關.由于鮮榨蘋果汁糖含量(底物濃度)較低,影響酵母菌發酵性能.因此進行適當濃度外源糖分添加在促進酵母菌充分快速發酵,確保發酵終產品良好風味、口感、香氣等品質形成方面具有重要作用.

為了確保酵母菌的充分發酵,本文采用蔗糖為酵母菌提供額外碳源成分.從圖1(d)可以看出,隨著蔗糖添加量的增加,發酵液SOD活力呈現出先快速升高而后快速下降的趨勢.蔗糖添加量小于6.0% w/v時,隨著蔗糖添加量增加,酵母菌代謝速率加快,發酵液SOD活力快速升高.蔗糖添加量達到6.0% w/v時,發酵液SOD活力達到峰值(123.69±2.93 U/mL).蔗糖添加量超過6.0% w/v后,發酵液SOD活力快速下降.分析認為蔗糖添加量過高會降低蘋果汁水活度,抑制酵母菌代謝活性,從而導致SOD活性降低[25].

此外,本文雖未對發酵過程中外加糖分(蔗糖)的含量變化進行檢測,但研究發現蔗糖添加量對發酵液SOD活力具有顯著影響(如圖1(d)所示),結合前人有關鮮食葡萄汁加糖發酵過程中外加糖分含量持續降低的結果,作者推測本文中蘋果糖類物質以及外加糖分(蔗糖)均為酵母菌發酵的碳源.酵母菌先快速代謝蘋果中主要單糖(果糖和葡萄糖),然后利用蘋果中雙糖及外加蔗糖持續發酵[26].綜上,蘋果酵素酵母菌發酵蔗糖添加量控制在6.0% w/v左右進行響應面試驗.

2.1.5 蘋果汁初始pH的考察

從圖1(e)可以看出,蘋果汁初始pH低于4.0時,發酵液SOD活力隨著pH的增加而逐漸升高.蘋果汁初始pH為4.0時,發酵液SOD活力達到峰值(122.53±1.42 U/mL).蘋果汁初始pH超過4.0之后,發酵液SOD活力逐漸降低.培養基pH是影響微生物發酵的重要參數之一,對培養基營養物質穩定性、菌體生物酶活性維持、菌體細胞結構穩定等至關重要[27].研究表明,微酸性環境有利于酵母菌的生長代謝[28],推測pH 4.0(微酸性)是本文所用的釀酒酵母菌的適宜生長pH.因此蘋果酵素酵母菌發酵蘋果汁初始pH控制在4.0左右進行響應面試驗.

圖1 蘋果酵素酵母菌發酵單因素試驗結果

2.1.6 蘋果酵素酵母菌發酵響應面試驗結果

SOD酶活力(U/mL)=161.32+6.24a+1.01b-

2.00c-0.67d-6.50ab-0.29ac+2.31ad+

0.56bc-0.27bd-1.06cd-4.35a2-15.70b2-

19.54c2-23.37d2

(1)

式(1)中:a-發酵時間(h);b-發酵溫度( ℃);c-蔗糖添加量(w/v);d-蘋果汁起始pH.

基于上述回歸方程,得到蘋果酵素酵母菌發酵的理論最優工藝關鍵參數為:發酵溫度28.87 ℃、發酵時間19.71 h、蔗糖添加量5.54% w/v、蘋果汁初始pH 4.45,在此條件下模型預測的SOD活力為151.51 U/mL.考慮到實際操作,將上述工藝參數修改為發酵溫度29 ℃、發酵時間20 h、蔗糖添加量5.5% w/v、蘋果汁初始pH 4.5、酵母菌接種量1% v/v,此條件下3次重復試驗的SOD活力為149.32±2.58 U/mL,與模型擬合理論值相近,說明響應面優化回歸模型參數真實可靠.

表1 響應面試驗設計和結果

表2 響應面模型的統計分析結果

2.2 蘋果酵素乳酸菌發酵工藝優化結果

2.2.1 發酵溫度的考察

從圖2(a)可以看出,隨著發酵溫度的逐步升高,兩株乳酸菌(植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌)代謝活性可能逐步加強,發酵液中乳酸菌濃度及總酸含量均逐步增加.發酵溫度為37 ℃時,發酵液中乳酸菌濃度(鼠李糖乳桿菌:6.19±0.23 lg CFU/mL;植物乳桿菌:5.71±0.04 lg CFU/mL)及總酸含量(鼠李糖乳桿菌:3.65±0.47 g/L;植物乳桿菌:3.31±0.37 g/L)均達到峰值.進一步提高發酵溫度,乳酸菌濃度及總酸含量均逐步降低.兩株乳酸菌對比來看,在相同發酵溫度下,鼠李糖乳桿菌各項指標值均優于植物乳桿菌,這可能與乳酸菌的發酵特性具有種屬間差異相關[29].因此蘋果酵素乳酸菌發酵溫度控制在37 ℃左右進行響應面試驗.

2.2.2 發酵時間的考察

從圖2(b)可以看出,隨著發酵時間的延長,兩株乳酸菌持續代謝酵母菌發酵后蘋果汁中營養成分產生大量有機酸,導致發酵液總酸含量持續增加.發酵20 h后,乳酸菌濃度與總酸含量的增加逐漸趨于平緩(鼠李糖乳桿菌濃度:6.10±0.18 lg CFU/mL;植物乳桿菌濃度:5.88±0.15 lg CFU/mL;總酸/鼠李糖乳桿菌:4.07±0.36 g/L;總酸/植物乳桿菌:3.95±0.26 g/L).在相同發酵時間下,鼠李糖乳桿菌各項指標值均優于植物乳桿菌.考慮到實際生產成本,蘋果酵素乳酸菌發酵時間控制在20 h左右進行響應面試驗.

2.2.3 接種量的考察

由圖2(c)可以看出,隨著兩株乳酸菌接種量的增加,發酵液乳酸菌濃度和總酸含量均呈現增長趨勢.接種量達到1% v/v后,乳酸菌濃度及總酸含量的增加趨于平緩(鼠李糖乳桿菌濃度:5.96±0.21 lg CFU/mL;植物乳桿菌濃度:5.78±0.14 lg CFU/mL;總酸/鼠李糖乳桿菌:3.94±0.29 g/L;總酸/植物乳桿菌:3.70±0.08 g/L).在相同接種量下,鼠李糖乳桿菌各項指標值均優于植物乳桿菌.考慮到實際生產成本,蘋果酵素乳酸菌發酵接種量控制在1% v/v為宜.

2.2.4 發酵液初始pH的考察

由圖2(d)可以看出,植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發酵的最適pH介于6.3～6.7之間,在此pH范圍內,發酵液乳酸菌濃度(鼠李糖乳桿菌:6.32±0.28 lg CFU/mL;植物乳桿菌:6.10±0.11 lg CFU/mL)和總酸含量(鼠李糖乳桿菌:4.16±0.36 g/L;植物乳桿菌:4.04±0.18 g/L)均達到峰值.發酵液初始pH低于或高于此范圍,乳酸菌濃度和總酸含量均呈現出下降趨勢.在發酵液初始pH相同條件下,鼠李糖乳桿菌各項指標值均優于植物乳桿菌.考慮到蘋果汁中酵母菌發酵的可持續性,蘋果酵素乳酸菌發酵發酵液初始pH控制在6.3左右進行響應面試驗.

圖2 蘋果酵素乳酸菌發酵單因素實驗結果

2.2.5 蘋果酵素乳酸菌發酵響應面實驗結果

表3 響應面試驗設計與結果

表4 響應面模型的統計分析結果

通過Design-Expert軟件對試驗數據進行分析,得到二次多項回歸方程如下:

總酸含量(g/L)=1.44-0.014a-0.013b+0.085c-0.013ab+0.007 2ac-0.002 7bc-0.14a2-0.17b2-0.17c2

(2)

式(2)中:a-發酵溫度( ℃);b-發酵液初始pH;c-發酵時間(h).

基于上述回歸方程,得到蘋果酵素乳酸菌發酵的理論最優工藝參數為:發酵溫度37.18 ℃、發酵時間23.12 h、發酵液初始pH 6.24,在此條件下模型預測的總酸含量為4.25 g/L.考慮到實際操作,將上述工藝參數修改為發酵溫度37 ℃、發酵時間23 h、發酵液初始pH 6.2、乳酸菌接種量1% v/v,此條件下3次重復試驗的總酸含量為3.98±0.34 g/L,與模型擬合理論值相近,說明響應面優化回歸模型參數真實可靠.

2.3 蘋果酵素發酵工藝優化結果

基于上述蘋果酵素酵母菌和乳酸菌發酵工藝優化結果,得到蘋果酵素發酵工藝關鍵參數如下:蘋果汁中添加5.5% w/v蔗糖并調節蘋果汁pH 至4.5,接種釀酒酵母進行發酵,發酵溫度29 ℃,接種量1% v/v,發酵20 h后蘋果汁發酵液SOD活力達到峰值(149.32±2.58 U/mL);而后調節發酵液pH至6.2、接種鼠李糖乳桿菌繼續發酵,發酵溫度37 ℃,接種量1% v/v,發酵時間23 h.制備的蘋果酵素SOD活力為158.54±1.32 U/mL,釀酒酵母濃度為7.66±0.20 lg CFU/mL,鼠李糖乳桿菌濃度為6.47±0.14 lg CFU/mL,總酸含量為3.98±0.34 g/L.

2.4 蘋果酵素抗氧化性結果

對最優工藝條件下制備的蘋果酵素的抗氧化性進行了初步檢測.由表5可以看出,蘋果酵素羥基自由基清除率、鐵離子還原力以及總酚含量相比于對照組(未發酵蘋果汁)分別提高了90.70%、77.78%和93.23%, 說明酵母菌+乳酸菌分段發酵可大幅提高蘋果汁抗氧化性.Karaman等[30]研究指出酚類物質能很容易地給出H+,并通過共振雜化而穩定,從而表現出較高自由基清除率.因此,酵素羥基自由基清除率的增強與酵素總酚含量的增加具有一定相關性[31].自由基清除率也與有機酸的羥基取代基、分子數量以及芳香環數量等密切相關[32].

本文雖然未對酵素總酸的具體成分進行檢測,但查閱相關報道可知水果酵素中有機酸主要為乳酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸等,多種有機酸的綜合作用可顯著提高自有基清除力[33].此外,酵素中釀酒酵母細胞壁上的多糖也具有一定的自由基清除力[34].因此,蘋果酵素表現出良好抗氧化性.與食品天然抗氧化劑(Vc和水溶性維生素E)以及合成抗氧化劑(BHA、BHT)相比,單菌(乳酸菌)發酵蘋果汁的DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率顯著增強,但鐵離子還原能力不及Vc[35,36].本文所采用的混菌發酵可以利用微生物之間互利共生關系進一步豐富蘋果汁中微生物代謝產物,因此作者推測混菌(酵母菌+乳酸菌)發酵蘋果酵素的抗氧化性強于Vc、BHT、BHA等食品抗氧化劑,但還需后期通過體外及體內試驗進行充分驗證.

表5 蘋果酵素抗氧化功能結果

3 結論

本研究結合陜西地區農業經濟特色,對陜西大宗水果資源-蘋果酵素的發酵工藝進行了系統優化,并初步檢測了酵素的抗氧化功能.通過單因素實驗和響應面試驗,明確了蘋果酵素酵母菌發酵的最優工藝參數為:發酵溫度29 ℃、接種量1% v/v、蔗糖添加量5.5% w/v、蘋果汁初始pH 4.5,發酵20 h后蘋果汁發酵液SOD活力達到峰值(149.32±2.58 U/mL);而后接種鼠李糖乳桿菌繼續發酵,最優工藝參數為:發酵溫度37 ℃、發酵液初始pH 6.2、接種量1% v/v、發酵時間23 h.此條件下制備的蘋果酵素SOD 活力為 158.54±1.32 U/mL,釀酒酵母濃度為 7.66±0.20 lg CFU/mL,鼠李糖乳桿菌濃度為 6.47±0.14 lg CFU/mL,總酸含量為3.98±0.24 g/L.制備的蘋果酵素羥基自由基清除率、還原力以及總酚含量相比于對照組(未發酵蘋果汁)分別提高了90.70%、77.78%和93.23%,表現出良好的抗氧化性.研究結果為促進陜西大宗水果資源-蘋果精深加工產業鏈的發展提供技術支撐.