4種水產消毒劑對棘胸蛙蝌蚪急性毒性研究

謝永廣,魏朝宇,魏秀英,羅華輝,陳敦學

( 貴州大學 動物科學學院,貴州大學漁業資源與環境研究中心,貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025 )

作為重要的水產養殖品種,目前兩棲類養殖規模日益擴大,水產消毒劑的使用已不可避免。為確保水產消毒劑僅具有消毒效果,而對養殖水產動物和自然環境呈低毒或無毒作用,首先應該優化消毒劑的使用劑量[1]。蝌蚪長期生活在水中,其鰓和皮膚具有較好的滲透性,對藥物較為敏感[2],利用蝌蚪進行急性毒性試驗已經成為一種標準方法[3]。目前對蝌蚪的急性毒性試驗主要集中在重金屬類,如評價Cu2+和Cd2+對中華蟾蜍(Bufogargarizans)[4-5]、澤陸蛙(Fejervaryamultistriata)[6]、海陸蛙(F.cancrivora)[7]的影響,以及Cr6+對中國林蛙(Ranachensinensis)的急性毒性試驗等[8]。

關于氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀、聚維酮碘等常見水產消毒劑對兩棲類急性毒性的研究尚較少。目前僅有:程劍等[9]分析了4種消毒劑對黑斑蛙(R.nigromaculata)毒性的影響,認為黑斑蛙蝌蚪對高錳酸鉀敏感性最強,而除氯化鈉屬于低毒性消毒劑外,硫酸銅、高錳酸鉀、聚維酮碘等均屬于中毒性消毒劑,使用過程中要控制好用量;梁成斌等[10]分析了高錳酸鉀和氯化鈉對東北林蛙(R.dybowskii)蝌蚪的急性毒性影響;Langhans等[11]研究表明,氯化鈉質量濃度為5600 mg/L時,東北林蛙蝌蚪大量死亡;Santana等[12]發現,甲醛對牛蛙(Lithobatescatesbeianus)蝌蚪的96 h半致死質量濃度為10.53 mg/L。

不同種類蝌蚪在生物學特性上的種屬差異導致對化學品的敏感性也存在差異[12],因此實際操作中,一般依托本地兩棲類模式生物進行研究,棘胸蛙(Quasipaaspinosa)作為我國特有的一種大型食用蛙類,主要分布在我國南方八省,具有良好的養殖前景,目前養殖規模不斷擴大,從業人數較多。同時,棘胸蛙對生存環境要求苛刻,被稱為生態環境的晴雨表,對環境變化非常敏感,是進行急性毒性試驗的優質材料[13]。因此,筆者以棘胸蛙蝌蚪為試驗材料,采用水生生物急性毒性試驗方法,研究4種常見水產消毒劑氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀和聚維酮碘對其的急性毒性作用,以期為棘胸蛙的規范養殖和安全用藥提供依據,并為常用水產消毒劑對兩棲類急性毒性的評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用棘胸蛙蝌蚪采自貴州省黔東南州臺江縣,試驗前將蝌蚪培養至38～39期(Gosner分期[11]),約50日齡,在室內養殖池暫養7 d后,選出規格相近、活動性好的健康蝌蚪進行毒性試驗。試驗蝌蚪的平均體質量為(0.79±0.22) g,平均體長(吻端至尾端)為(43.00±0.81) mm。試驗用水為充分曝氣3 d以上的自來水,水溫(20±1) ℃、pH 7.2、溶解氧≥5.5 mg/L,自然光周期條件下培養。

試驗所用試劑氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)、甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)和高錳酸鉀(廣東航鑫科技股份公司)均為分析純,聚維酮碘(PVP-I)(湖北五湖漁業股份有限公司)有效含量≥99%,有效碘含量為10%。并按照使用說明采用雙蒸水配制成母液,試驗時稀釋到使用質量濃度即可。

1.2 試驗方法

通過預試驗確定棘胸蛙蝌蚪24 h致死質量濃度下限值及96 h無死亡質量濃度上限值,確定正式試驗的藥物質量濃度。開始試驗時,氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀、聚維酮碘4種藥物按等對數間距分別設置5個質量濃度組,同時再設定1個空白對照組。4種藥物的質量濃度梯度見表1。每個試驗容器中有藥液10 L,每個質量濃度處理隨機放置20尾蝌蚪,并設置3個平行。采取靜態-更新的方法[14],每12 h換水50%,并加入不同質量濃度的相應藥物,試驗前1 d及試驗期間禁食[15]。試驗開始后的前8 h連續觀察供試蝌蚪的中毒癥狀,然后每隔12 h為時間點,觀察記錄蝌蚪在24、48、72、96 h死亡的數量,并及時清除死亡個體。判斷蝌蚪死亡的標準是用鑷子輕夾蝌蚪尾部,連續觀察30 s,若蝌蚪無反應,即認為蝌蚪已死亡[15]。

表1 4種水產消毒劑的試驗質量濃度Tab.1 Concentrations of four aquaculture disinfectants in the experiment

1.3 數據處理

采用改良寇式法計算各試驗組的半致死質量濃度(LC50)及其95%置信區間,并以試驗質量濃度的對數為橫坐標、死亡率為縱坐標做直線回歸方程。藥物毒性蓄積程度系數參照文獻[9]方法計算,安全質量濃度(SC)按下式計算:

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

2 結 果

2.1 蝌蚪中毒癥狀描述

隨著消毒劑質量濃度增加,蝌蚪中毒癥狀逐漸明顯,高質量濃度氯化鈉處理后,蝌蚪反應劇烈,在水里狂游不止,并隨著作用時間延長,蝌蚪開始出現身體側翻或尾末端不自然彎曲,皮膚變暗,且死亡個體均呈現尾梢上翹癥狀;甲醛和高錳酸鉀處理后,蝌蚪死亡后體表黏液明顯增多;而聚維酮碘處理蝌蚪后,蝌蚪游動加快、反應劇烈,并不時出現身體顫抖,隨后便死亡,且隨著藥物質量濃度增加和作用時間延長,蝌蚪的致死效應加劇。

2.2 急性毒性特征分析

試驗期間,對照組棘胸蛙蝌蚪表現正常,無死亡現象;試驗組中,隨藥物質量濃度的增加和作用時間的延長,蝌蚪死亡率逐漸上升(表2)。氯化鈉質量濃度為8659.28 mg/L時,48 h蝌蚪死亡率超過50%[(57.67±0.94)%];當質量濃度為15 000 mg/L時,蝌蚪在48 h時即全部死亡。甲醛質量濃度達到10 mg/L時,蝌蚪72 h開始出現死亡,死亡率為(6.67 ± 0.47)%;質量濃度為22.36 mg/L時,72 h的死亡率超過50%[(56.67±1.25)%];質量濃度為50 mg/L時,48 h即全部死亡。高錳酸鉀質量濃度為2 mg/L時,96 h開始出現死亡;質量濃度為4.47 mg/L時,72 h死亡率超過50%[(55.00±0.82)%];質量濃度為10.00 mg/L時,48 h即全部死亡。聚維酮碘質量濃度為3.74 mg/L時,72 h的死亡率超過50% [(50.00±2.45)%];質量濃度為7.00 mg/L時,24 h即全部死亡。

表2 4種水產消毒劑對棘胸蛙蝌蚪的致死率Tab.2 The mortality of frog Q. spinosa tadpoles exposed to four aquaculture disinfectants

2.3 半致死質量濃度和毒性蓄積效應

氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀和聚維酮碘對棘胸蛙蝌蚪半致死質量濃度和毒性蓄積效應見表3。半致死質量濃度隨作用時間的延長所需消毒劑質量濃度逐漸下降,其中4種消毒劑24、48、72、96 h的半致死質量濃度排列均為:氯化鈉>甲醛>高錳酸鉀>聚維酮碘。氯化鈉、甲醛、高錳酸鉀、聚維酮碘4種藥物對棘胸蛙蝌蚪96 h的半致死質量濃度分別為7145.53、16.32、3.61、2.93 mg/L。依據安全質量濃度計算方法,得到4種消毒劑安全質量濃度分別為1949.01、4.80、0.88、1.85 mg/L。藥物毒性蓄積程度系數呈現較大的差異,其中氯化鈉和甲醛處理組隨著作用時間延長,藥物毒性蓄積程度系數呈下降趨勢,且氯化鈉處理下降較快,藥物蓄積效應差,而高錳酸鉀和聚維酮碘處理組的藥物毒性蓄積程度系數在96 h內呈現先降后升的現象。通過回歸分析得到棘胸蛙蝌蚪死亡率(y)與消毒劑質量濃度對數(x)的回歸方程(表4),所有回歸方程均呈上升趨勢,說明隨著藥物作用時間的延長,死亡率會逐漸上升。

表3 4種消毒劑對棘胸蛙蝌蚪急性毒性特征分析Tab.3 Acute toxicity characteristics of four aquaculture disinfectants for frog Q. spinosa tadpoles

表4 4種水產消毒劑對棘胸蛙蝌蚪毒性的回歸分析Tab.4 Regression equations of four aquaculture disinfectants for frog Q. spinosa tadpoles

3 討 論

3.1 棘胸蛙蝌蚪消毒劑敏感性分析

目前利用本土兩棲類作為化學品毒性的生物測試方法已成為共識[3],如蘇紅巧等[16]建立了利用蝌蚪進行急性毒性試驗標準。然而我國本土的兩棲類種類較多,包括黑斑蛙[10]、海陸蛙[7]、中華蟾蜍[5]、棘胸蛙[13]等,且不同的物種存在生物學上的種屬特異性,對化學品的敏感性也存在差異。隨著我國生態文明建設的進一步深入,選擇一種對化學品敏感且容易獲得的本土蛙類進行相關急性毒性試驗,對進行生態環境監測具有重要意義。本試驗中的棘胸蛙蝌蚪對聚維酮碘的敏感性遠遠高于黑斑蛙[9];對高錳酸鉀的敏感性略低于黑斑蛙[9]和東北林蛙[10];對氯化鈉的敏感性與黑斑蛙[9]基本相同,而高于東北林蛙[11];對甲醛的敏感性低于東北林蛙[11]和牛蛙[12],但高于黃尾鲴(Xenocyprisdavidi)[17]和花鰻鱺(Anguillamarmorata)幼魚[18]。以上結果說明棘胸蛙蝌蚪可以作為環境毒性的監測生物。此外,高錳酸鉀的使用具有溫度依賴性[19-20],在實際生產中養殖戶很難把握合適的使用劑量,因此建議使用聚維酮碘作為消毒劑。

3.2 4種消毒劑的毒性特征與用藥安全

正確合理地使用消毒劑可以有效控制許多細菌、寄生蟲和真菌的暴發,減少抗生素的使用。半致死質量濃度是評價藥物對水產動物急性毒性的重要指標,試驗結果顯示,氯化鈉和甲醛對棘胸蛙蝌蚪的96 h半致死質量濃度分別為7145.53、16.32 mg/L,大于10.0 mg/L,屬于低毒消毒劑;高錳酸鉀和聚維酮碘的96 h半致死質量濃度分別為3.61、2.91 mg/L,介于1.0～10.0 mg/L內,屬于中毒消毒劑[21]。類似的結果在其他蛙類中也有報道,如:高錳酸鉀對東北林蛙蝌蚪[10]和黑斑蛙蝌蚪[9]的96 h半致死質量濃度分別為1.098、1.803 mg/L,遠低于一般養殖魚類[18,22];甲醛對牛蛙蝌蚪[12]的96 h半致死質量濃度分別為16.32、10.53 mg /L,遠低于花鰻鱺幼魚(88.78 mg/L)[18]和黃尾鲴(72.30 mg/L)[17];氯化鈉對黑斑蛙蝌蚪[9]的96 h半致死質量濃度為7348.56 mg/L,同時在氯化鈉質量濃度為5600 mg/L時,東北林蛙[11]出現大量死亡,均低于黃尾鲴(9664.36 mg/L)[17]、西雜鱘幼魚(8.17 mg/L)[23]和花鰻鱺幼魚(22 278 mg/L)[18]的96 h半致死質量濃度。由此推斷,兩棲類蝌蚪對消毒劑的敏感性通常高于魚類,利用兩棲類檢測環境中的微量毒物及環境污染情況,具有重要的應用價值和參考作用。

本試驗中,高錳酸鉀對棘胸蛙蝌蚪的安全質量濃度為0.88 mg/L,高于黑斑蛙[9]的0.27 mg/L,也高于東北林蛙[10]的0.534 mg/L,然而卻遠低于生產使用量10 mg/L,同時已有研究證明,高錳酸鉀的消毒效果不存在劑量依耐性[1],因此如采用高錳酸鉀作為消毒劑,建議通過降低使用劑量和延長消毒時間的方式進行。聚維酮碘對棘胸蛙蝌蚪的安全質量濃度為1.85 mg/L,低于黑斑蛙蝌蚪[9]的安全質量濃度2.71 mg/L,也低于西雜鱘幼魚[23]的安全質量濃度2.37 mg/L,甚至低于生產上使用的劑量2～4 mg/L,因此在棘胸蛙蝌蚪養殖過程中,使用聚維酮碘作為消毒劑時使用要減少用量,以免造成損失。氯化鈉對棘胸蛙蝌蚪安全質量濃度為1949.01 mg/L,低于黑斑蛙[9]的安全質量濃度2204.6 mg/L,通常生產上僅用氯化鈉下塘前浸泡消毒苗種,而少用于水體潑灑。甲醛對棘胸蛙蝌蚪的安全質量濃度為4.8 mg/L,遠低于常用消毒劑量30 mg/L,因此,使用甲醛作為消毒劑時應該嚴格控制其使用劑量,或者及時換水。綜上,為發揮消毒劑最優消毒效果以及避免在養殖過程中對棘胸蛙等兩棲類造成較大傷害,消毒劑的使用可選擇減少劑量和適當延長消毒時間這種方式。

3.3 消毒劑的殺菌原理分析

高錳酸鉀作為一種強效氧化劑,主要通過產生抑制性化合物和增強免疫反應來保護宿主[24]。過量的高錳酸鉀通過改變魚體表面微生物菌群的群落組成,將消滅對高錳酸鉀較為敏感的革蘭氏陰性菌,進而降低致病菌感染難度[1]。一些水產動物對高錳酸鉀具有較好的降毒解毒能力,在48～72 h內,高錳酸鉀的藥物毒性蓄積程度系數下降一半以上,具有較低的藥物蓄積效應。因此在高錳酸鉀消毒后,只要魚類沒有死亡則可以很快恢復,如高錳酸鉀處理斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)后使其鰓輕度肥大并產生海綿狀增生,但是經過48 h治療后,即可恢復正常[24]。氯化鈉是比較安全的魚類養殖常規消毒殺菌藥物,通過改變機體的滲透壓來殺滅一些寄生蟲和病原微生物,對治療魚類的水霉病、寄生蟲病和細菌性疾病有一定的效果,但是生產上主要用于魚苗下塘消毒[25]。聚維酮碘與有機物相互作用后,將具有殺菌作用的游離碘還原為碘化物,因此聚維酮碘消毒效果具有劑量依耐性,Silas等[26]發現,通過連續多次添加較低劑量的聚維酮碘可以取得與較高劑量聚維酮碘相似的消毒效果,可以避免高劑量的聚維酮碘引起水產動物中毒。甲醛主要通過烷基化反應使菌體蛋白變性,進而起到殺菌作用,主要用于對硫酸銅等藥物敏感的魚類[17]。

4 結 論

在4種水產消毒劑中,氯化鈉和甲醛屬于低毒消毒劑,而高錳酸鉀和聚維酮碘屬于中毒消毒劑。充分考慮劑量敏感性和使用方便性,推薦使用聚維酮碘作為消毒劑。此外蝌蚪對消毒劑的敏感性通常高于魚類,因此在棘胸蛙等兩棲類養殖過程中,消毒劑的使用需要減少劑量。