不同pH下五溴聯苯醚BDE-85對海水小球藻的毒性效應

姜樂樂,郝夢秋,顧小朵,郭晨宇,李富田,王洪斌

( 江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院,江蘇 連云港 222005 )

隨著工農業快速發展,海洋環境污染已然是全球性的問題,自上世紀后期以來,多溴聯苯醚(PBDEs)在各類工業產品中當作阻燃劑被普遍使用,雖然它的應用起始階段比較晚,急性毒性低,但其持久污染性導致的慢性毒性很嚴重,也可沿著食物鏈富集,光化學降解是環境中多溴聯苯醚的重要降解途徑之一[1]。五溴聯苯醚BDE-85性質穩定且難以降解,焚燒或浸泡含有PBDE-99的工業廢物,能使其通過蒸發和滲漏等進入環境中,在水體、大氣、土壤、海洋生物及人體等生物和非生物樣本中均能檢測到BDE-99[2-8],研究證明,多溴聯苯醚對乳腺癌細胞的相關腫瘤的發生和發展有一定的影響[9]。李玉芳等[10]在沿海魚類體內均檢出高含量的低溴代的PBDE-47和高溴代的PBDE-209,后者在某些水產品的檢出率和檢出劑量有逐年上升的趨勢。現已證實,多溴聯苯醚可以通過食物鏈在海洋生物的體內富集并且產生毒性效應[11]。海洋微藻作為初級生產者,多溴聯苯醚對它有更強的急性毒性和遺傳毒性,雖然由于微藻細胞壁結構的差異導致富集能力不同,但對其抗氧化防御系統的破壞作用也較強[12],并且微藻體內的多溴聯苯醚的富集與氮磷比、營養鹽濃度、氮濃度等環境因子密切相關[13-17]。目前關于多溴聯苯醚對海洋微藻毒性脅迫效應的研究鮮有報道,國內研究也剛起步,主要分析微藻在受到多溴聯苯醚的脅迫后,其生長狀況、光合系統和抗氧化防御系統在暴露后的響應[18]。不同海洋微藻對多溴聯苯醚的響應具有差異性[18]。

隨著人類活動的干預,排放的大量CO2通過海氣界面進入海洋,打破海洋原有的碳酸鹽平衡進而造成海洋酸化。海洋酸化直接導致海洋中污染物的理化性質改變與毒性效應增強。如海洋酸化能夠影響重金屬的溶解并改變其離子形態與比例[19]、抑制有機污染物的降解[20],影響微塑料的吸附行為等[21],進而引發毒性效應的改變。全球氣候變化下的污染物海洋生物效應為當前環境領域關注的熱點和前沿問題,筆者聚焦不同pH條件下的多溴聯苯醚對海水小球藻(Chlorellavulgaris)的毒性效應,探討pH和污染物雙重脅迫對小球藻的生長、光合作用和氧化應激效應的影響等,旨為海洋污染防控及管理決策提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

試驗用海水小球藻為江蘇海洋大學海洋藻類生物學研究室保存藻種。小球藻培養采用人工海水,配方:NaCl 490.80 g,KBr 2.00 g,KCl 14.00 g,H3BO30.06 g,Na2SO481.80 g,NaHCO33.70 g,NaF 0.06 g,CaCl2·2H2O 30.80 g,MgCl2·6H2O 222.00 g,SrCl2·6H2O 0.34 g,ddH2O 20 L。小球藻培養基采用通用的f/2營養液。

1.2 試劑

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;五溴聯苯醚選取的試劑為BDE-85(C12H5Br5O),購于上海源葉生物科技有限公司,需溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中配制成母液(25 μg/mL)使用(已有研究表明,N,N-二甲基甲酰胺對藻類的生長沒有影響[22]);其他試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

小球藻的培養條件:光照培養箱培養(GXZ-500C,寧波江南儀器廠),光照周期為12L∶12D,培養溫度為25 ℃,培養光照度為8300 lx。pH梯度設置:8.66、8.44、8.19、7.93,pH梯度通過HCl和NaOH調節,pH計(Seven Easy, METTLER)測定。BDE-85含量梯度設置[22]:0、1.52、3.04、6.08、12.16、24.32 μg/g,每個含量設置3個平行。人工海水經高壓滅菌鍋(YXQ-LS-50SH,上海博訊實業有限公司)105 ℃滅菌15 min,500 mL PC瓶100 ℃滅菌5 min,按1000∶1(體積比)加入過濾除菌的f/2營養液,藻種活化2～3 d達到指數生長期,接種密度約為2.5×104個/mL的小球藻藻液1 mL至500 mL的培養液中,接種密度達50個/mL,搖勻后置于光照培養箱培養2 d后取樣觀察。向對應的BDE-85含量梯度培養瓶中,分別加入BDE-85母液,使各組終含量分別為0、1.52、3.04、6.08、12.16、24.32 μg/g,每隔24 h取樣進行測定分析(取100 mL培養藻液濃縮藻密度至約100×104個/mL),培養期間及時補充營養液,使小球藻生長始終保持在對數生長期,并且等比例加入BDE-85,調節并保持培養過程中培養液的pH不變,保持藻液密度約為3×104個/mL。在加入BDE-85的24 h后,開始持續3 d測定超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性(試劑盒檢測,南京建成生物工程公司;全波長酶標儀,ReadMax1900,上海閃譜生物科技有限公司),連續5 d測定生長量,第4天測定光合放氧速率和葉綠素熒光參數等。小球藻培養期間,每天振搖數次,隨機調換培養瓶位置,并在固定時間取樣分析。試驗過程中所有操作均嚴格控制在無菌條件下進行(超凈工作臺,SW-CJ-ZF,蘇州凈化設備有限公司)。

1.3.2 比生長速率測定

連續5 d測定生長量,取濃縮藻液2～3 mL,立刻加入魯哥試劑固定,保存于4 ℃冰箱中,便于后續計數,計算比生長速率。將固定后的藻液充分搖勻后,取100 μL使用0.1 mL浮游計數板(DSJ-01,廈門登迅儀器設備有限公司)在顯微鏡下計數,每個樣品每次計數重復3次,降低計數的試驗誤差。比生長速率按下式計算:

μ=( lnN1-lnN0)/(t1-t0)

式中,N1為當天計數所得每毫升藻液中所含藻量,N0為前一天或前幾天計數所得每毫升藻液中所含藻量,t1-t0為兩次計數之間所隔時間。

1.3.3 超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性測定

無菌條件下取1 mL待測濃縮藻液,放置在1.5 mL的離心管中,4 ℃、5000 r/min離心(離心半徑7.5 cm)10 min,棄去上清液,沉淀物加1 mL生理鹽水,超聲波破碎法[23]破碎海水小球藻細胞(HD2200,寧波新芝生物科技股份有限公司;破碎條件:功率195 W,超聲波工作時間3 s,間歇時間7 s,破碎強度65%,工作時間10 min),顯微鏡下觀察到無完整藻細胞后,再次離心,離心參數同上,取上清液檢測超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性。按檢測試劑盒說明書進行。

1.3.4 凈光合放氧速率和暗呼吸速率測定

使用液相氧電極(17304,漢莎科學儀器有限公司)來測定海水小球藻的光合放氧和呼吸耗氧速率,注意8300 lx的光照度點及保持壓強在0.02 MPa以下,防止微藻破裂死亡,并且保證每次加入的測定藻樣液為2 mL,藻液的細胞密度要通過顯微鏡精準計數,以供計算速率時所需。

1.3.5 葉綠素熒光參數測定

將濃縮的待測藻液3 mL放入葉綠素熒光測定儀(PAM,AP100,捷克)的比色皿中,光照度設置為8300 lx,先測定藻細胞活性(QY),再測定其快速光響應曲線(RLC),利用公式計算相對電子傳遞速率(rETR):

rETR= PAR×Y×0.5

式中,PAR為光合有效輻射,Y為光系統Ⅱ的有效光化學量子產量。

快速光響應曲線擬合使用的公式:

rETR=PAR/(a×PAR2+b×PAR+c)

式中,a、b、c均表示擬合曲線中的常數。

通過a、b、c的值計算電子傳輸效率(α)、rETR的最大值(rETRmax)和飽和輻照點(Ik):

α=1/c

rETRmax=1/[b+2(a×c)1/2]

Ik=c/[b+2(a×c)1/2]

1.3.6 數據分析

試驗數據使用Origin 2018軟件分析處理作圖,用不同字母表示數據差異顯著,即t檢驗中P<0.05。

2 結果與分析

2.1 小球藻的比生長速率

不同pH條件下BDE-85含量的比生長速率見圖1。在4種pH梯度(8.66、8.44、8.19、7.93)下,3.04 μg/g和6.08 μg/g試驗組的比生長速率相較于對照組均明顯升高,經單因素方差分析,可知每個pH條件下的6.08 μg/g試驗組與其對照組間差異顯著(P<0.05),分別高出對照組22.87%、9.29%、18.94%、19.77%;pH 8.66、pH 8.44和pH 7.93這3個梯度的24.32 μg/g試驗組和對照組之間差異顯著(P<0.05),比對照組分別低39.06%、30.45%、14.93%;在4種pH梯度下,24.32 μg/g試驗組的比生長速率始終處于較對照組小的趨勢,說明BDE-85含量過高,對小球藻的生長產生明顯抑制作用;當pH為8.19時,只有6.08 μg/g試驗組的比生長速率相較于對照組有顯著差異(P<0.05),促進小球藻的生長,24.32 μg/g試驗組的比生長速率較對照組低15.83%;pH 7.93時的多個含量BDE-85處理組比生長速率較pH 8.19時普遍偏高。分析認為,酸化條件促進海水小球藻生長的同時,也在一定程度上抑制了BDE-85的致毒脅迫效應。結論與凈光合放氧速率和暗呼吸速率的結果相符合(待發表)。

圖1 不同pH和BDE-85含量下小球藻的比生長速率Fig.1 Specific growth rate of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同.Different superscipts represent significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.2 小球藻的凈光合放氧速率和暗呼吸速率

不同pH條件下6組含量BDE-85的凈光合放氧速率和暗呼吸速率見圖2和圖3。試驗結果表明,相較于pH 8.19時,其他3個pH條件下的凈光合放氧速率均明顯呈現上升趨勢,特別是pH 7.93時的凈光合放氧速率,在6個BDE-85含量組中分別比pH 8.19時高出283.33%、136.65%、594.98%、1879.35%、535.16%、1585.23%;而暗呼吸速率則呈下降趨勢,與pH 8.19時相比,pH 7.93各組中除對照組高出23.9%,其他5組分別降低46.57%、66.95%、12.32%、31.28%、43.15%。這表明低pH條件增強了對照組的暗呼吸速率和凈光合放氧速率。海水小球藻有機物的積累增加,且這個過程中所消耗的能量也隨之增加,總體上呈現出比生長速率上升趨勢,但BDE-85的加入使暗呼吸速率下降的同時,凈光合放氧速率上升,這種相反的趨勢表現出有機污染物的毒性在某種程度上被低pH條件減輕,生長加速,特別是6.08 μg/g試驗組存在顯著性差異。在pH 7.93條件下的組間的單因素方差分析中,6.08 μg/g試驗組的凈光合放速率與其他組均差異顯著(P<0.05),其暗呼吸速率與3.04、12.16、24.32 μg/g試驗組存在顯著差異,6.08 μg/g試驗組在低pH條件水平下凈光合放氧速率比對照組高出18.43%,24.32 μg/g試驗組則比對照組低39.98%。結合其比生長速率可以得出,在低pH條件下及本試驗設置的6種BDE-85含量梯度中,BDE-85含量為6.08 μg/g時對小球藻的緩解毒性效果最強。在低pH條件下的24.32 μg/g試驗組中,凈光合放氧速率和暗呼吸速率相較于對照組均存在顯著性差異,呈下降趨勢,推測原因是毒性過高使藻細胞受損,細胞活力減弱。

2.3 小球藻葉綠素熒光參數

4個不同pH條件下BDE-85含量的葉綠素熒光參數見表1。4個pH條件下均出現了光抑制作用,24.32 μg/g試驗組較其他5組的光抑制作用更明顯,α、Ik、rETRmax參數值波動較大。pH 8.44和pH 8.19時的α、Ik、rETRmax參數值不存在顯著性差異。由表1可見,比較對應BDE-85含量梯度的rETRmax參數值,pH 7.93時各BDE-85含量的rETRmax比pH 8.19時的rETRmax分別高出57.17%、64.30%、56.90%、46.71%、57.14%和66.30%。pH 7.93時的rETRmax偏高表明光系統Ⅱ的效率更高,光合作用增強,BDE-85的致毒效應被低pH條件緩解,但在低pH條件下,高含量24.32 μg/g試驗組與對照組相比受光抑制作用更加明顯,這也反映出高含量BDE-85對藻細胞光合系統穩定性產生一定的損害作用。

表1 不同pH和BDE-85含量下小球藻的葉綠素熒光參數Tab.1 Chlorophyll fluorescence parameters of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

2.4 小球藻的過氧化氫酶活性

在4個不同pH條件下,6個BDE-85含量組的過氧化氫酶活性變化趨勢見圖4。除pH 8.44條件下,其他3個pH條件下小球藻的過氧化氫酶活性在連續3 d的檢測中整體均呈上升趨勢,pH 8.66時3 d的上升趨勢顯著(P<0.05)。pH 8.19時,6.08 μg/g試驗組和24.32 μg/g試驗組與對照組相比差異顯著(P<0.05),pH 7.93時也存在相同結果,表明中含量6.08 μg/g及以上的BDE-85均能顯著刺激藻細胞產生應激反應,以抵抗BDE-85的損傷脅迫。同時pH 8.19條件下和pH 7.93條件下對比可知,連續3 d測定后者6.08 μg/g試驗組的過氧化氫酶活性比前者分別降低42.82%、36.81%和27.30%,說明低pH條件在該含量下顯著地緩解了BDE-85對藻細胞的毒害作用。試驗證實,24 h和48 h時藻細胞可能處于誘導激活酶活的反應過程,而且在低pH條件下,中、低含量的BDE-85的毒性可以被不同程度的緩解,24.32 μg/g試驗組的被緩解效果不佳,應該歸因于BDE-85含量太高,對藻細胞的損傷過強已經難以通過低pH條件緩解。

圖4 不同pH和BDE-85含量下小球藻的過氧化氫酶活性Fig.4 Catalase activity of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

2.5 小球藻的超氧化物歧化酶活性

4個pH條件下6個BDE-85含量組的小球藻超氧化物歧化酶活性變化趨勢見圖5。整體來看,隨著培養時間的增加,4個pH條件下的海水小球藻超氧化物歧化酶活性均表現出先升后降的趨勢。4個pH條件下的48 h和72 h時,6.08 μg/g試驗組的超氧化物歧化酶活性始終維持最高,與多個組存在顯著性差異(P<0.05),其中48 h時,6.08 μg/g試驗組相較對照組分別高出76.05%、37.59%、20.90%和39.45%,其在整體趨勢中超氧化物歧化酶活性最高。pH 8.19和pH 7.93條件下相比,后者整體活性比前者要高約10%,表明低pH條件促進了藻細胞產生超氧化物歧化酶,從而激活抗氧化系統清除氧自由基,以對抗BDE-85的毒性。但隨著時間的增加,BDE-85對藻細胞的超氧化物歧化酶調節系統應該存在某種程度的損傷,特別是4個pH條件下高含量24.32 μg/g試驗組與對照組相比分別降低了23.52%、29.29%、29.46%和16.35%,說明高含量BDE-85對藻細胞的損傷更嚴重。pH 7.93條件下的24.32 μg/g試驗組的超氧化物歧化酶活性在72 h呈現下降趨勢,并且超氧化物歧化酶活性始終不如6.08 μg/g試驗組的高,但二者的超氧化物歧化酶活性均顯示增強,分析認為,BDE-85和低pH條件的耦聯對超氧化物歧化酶的生理調節機制受BDE-85含量的影響較小。

圖5 不同pH和BDE-85含量下小球藻的超氧化物歧化酶活性Fig.5 Superoxide dismutase activity of green alga C. vulgaris at different BDE-85 concentrations and pH

3 討 論

3.1 不同pH條件下五溴聯苯醚BDE-85對小球藻光合特性的影響

高坤山[24]指出,藻類的二氧化碳濃縮機制(CCMs)會受到環境酸化的影響而下調,因此藻細胞獲得的光能量增多,這有利于增強光合作用,增加有機物的積累和細胞活力從而抵抗BDE-85的毒害作用。酸化條件下的海水小球藻的最大電子傳遞速率較對照組顯著性增加,但光抑制現象也同樣加劇,二氧化碳濃縮機制會使酸化條件下的小球藻更易受到高光脅迫,而高含量的BDE-85加劇了光抑制效應。在低pH條件下及設置的6種含量梯度中,BDE-85含量為6.08 μg/g時對小球藻的緩解毒性效果最強,高含量24.32 μg/g試驗組中,凈光合放氧速率和暗呼吸速率相較于對照組均存在顯著差異,呈下降趨勢。筆者認為,是由BDE-85含量過高、毒性過強使藻細胞受損嚴重,細胞活力嚴重減弱所致。pH 7.93 時各BDE-85含量相對應的最大電子傳遞速率普遍高于pH 8.16、8.66時,而pH 7.93時的最大相對電子傳遞速率偏高表明光系統Ⅱ的效率更高,說明光合作用增強,BDE-85的致毒效應被酸化緩解;但在低pH條件下,高含量24.32 μg/g試驗組與對照組相比,受光抑制作用更加明顯,這也反映出高含量BDE-85對藻細胞的光合系統的穩定性產生了一定的損害。試驗結果表明,低pH條件促進了小球藻生長的同時也在一定程度上緩解了BDE-85的毒性效應,小球藻的比生長速率、凈光合放氧速率和暗呼吸速率以及最大電子傳遞速率的結果均能驗證,但當BDE-85含量過高時,低pH條件的緩解效果弱于毒害作用。

3.2 不同pH條件下BDE-85對小球藻抗氧化系統的影響

高坤山[24]提到,酸化會影響藻類的生理調節機制、膜的氧化還原作用及其離子透過性。本試驗結果表明,低pH條件能顯著緩解BDE-85對藻細胞的毒害作用。試驗證實,24 h和48 h時藻細胞可能處于誘導激活酶活的反應階段,而且在低pH條件下,中、低含量BDE-85的毒性可以被不同程度的緩解,24.32 μg/g試驗組的被緩解效果不佳,應該歸因于BDE-85含量太高,對藻細胞的損傷過強已經難以通過低pH條件緩解。李卓娜等[25]研究發現,BDE-49對多種微藻的抗氧化特性、光合特性有影響,BDE-49對海洋微藻具有毒性,并且驗證了微藻的葉綠素熒光參數、電子傳遞速率和過氧化物酶活性等是判定BDE-49污染水平的標志性依據。本試驗結果顯示,低pH條件和高含量BDE-85的耦聯對過氧化氫酶的生理調節機制影響顯著,而BDE-85和低pH條件的耦聯對超氧化物歧化酶的生理調節機制受BDE-85含量的影響較小。筆者僅做了超氧化物歧化酶、過氧化氫酶兩種酶活性的檢測,可能具有一定的局限性,還需進一步研究探討。

筆者僅對單一藻種和單種多溴聯苯醚污染物進行了致毒脅迫效應的測定,下一步可以深入研究多種多溴聯苯醚污染物對某一種藻的致毒脅迫效應,從而模擬海水中的藻類生長狀況,為多溴聯苯醚污染的防治與管控提供理論依據。

4 結 論

(1)不同pH條件下,中、低含量的BDE-85對小球藻的生長有一定的促進作用,高含量的BDE-85對小球藻的生長有顯著抑制作用。

(2)低pH條件使經過中、低含量BDE-85處理的小球藻的抗氧化作用和光合作用增強,在一定程度上緩解了BDE-85的細胞毒性,穩定并促進小球藻的生長,但在高含量的BDE-85處理中,二者交互作用不明顯。