青海湖裸鯉實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因篩選與驗(yàn)證

劉思嘉,祁得林,祁洪芳,韓步鷹,牛依萌,趙 凱,田 菲

( 1.中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所,青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810008; 2.青海大學(xué),省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016; 3.青海湖裸鯉救護(hù)中心,青海湖裸鯉繁育與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青海 西寧 810016 )

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskiiprzewalskii)屬鯉科裂腹魚(yú)亞科裸鯉屬,僅分布于青海湖流域,是我國(guó)特有的珍稀高原魚(yú)類。青海湖裸鯉的物種形成與青藏高原的抬升密切相關(guān)[1],在長(zhǎng)期的適應(yīng)進(jìn)化中,能夠很好地適應(yīng)該地區(qū)嚴(yán)寒、低氧、高鹽堿、強(qiáng)紫外線等極端自然條件,無(wú)疑是一種研究生物耐逆的理想模型[2]。已有研究表明,青海湖裸鯉在高鹽環(huán)境下通過(guò)改變鰓和腎臟的組織形態(tài)進(jìn)行滲透和離子調(diào)節(jié),維持機(jī)體滲透壓穩(wěn)態(tài)[3];通過(guò)提高肝胰臟、腎臟組織中超氧化物歧化酶基因、酸性磷酸酶基因和堿性磷酸酶基因表達(dá)水平,來(lái)適應(yīng)高堿度環(huán)境[4]。由于青海湖裸鯉極端環(huán)境適應(yīng)的機(jī)制十分復(fù)雜,其背后的分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。解析青海湖裸鯉極端環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)變化,是探究青海湖裸鯉抗逆分子機(jī)制的前提。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR),是將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)合,對(duì)DNA或cDNA模板進(jìn)行定量檢測(cè),從而對(duì)靶基因在某組織、時(shí)間轉(zhuǎn)錄豐度或基因拷貝數(shù)定量的方法[5]。在魚(yú)類研究中,qRT-PCR常用于魚(yú)類基因功能研究[6],如抗逆分子機(jī)理研究[7]、魚(yú)類病理學(xué)[8]、病原學(xué)檢測(cè)[9]、免疫應(yīng)答[10]、環(huán)境毒理學(xué)[11]及代謝通路調(diào)控[12]等方面。除了斑馬魚(yú)(Daniorerio)[13]、青鳉(Oryziaslatipes)[14]等模式生物外,qRT-PCR技術(shù)也廣泛應(yīng)用于多種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類和野生魚(yú)類的研究中,如鯉(Cyprinuscarpio)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[15]、非洲麗魚(yú)(Astatotilapiaburtoni)[16]等。

在qRT-PCR中,最常用的方法是利用一個(gè)已知的、表達(dá)穩(wěn)定的基因來(lái)校正目標(biāo)基因的Ct值,用于校正數(shù)據(jù)的基因稱作內(nèi)參基因或管家基因(HKGs)[17]。內(nèi)參基因是矯正基因表達(dá)的必要參照,篩選合適的內(nèi)參基因能夠減少試驗(yàn)誤差,提高結(jié)果可靠性。常用的內(nèi)參基因主要包括肌動(dòng)蛋白β(Act-β)基因[18-19]、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)基因[19]、真核生物延伸因子(Ef-1α)基因[20-21]、核糖體蛋白L13(Rpl13)基因[22]、琥珀酸脫氫酶亞基A(Sdha)基因[23]、次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)基因[24]等,這些常用的內(nèi)參基因,或參與細(xì)胞的基本代謝,或作為細(xì)胞的組成成分,在不同器官、組織中的表達(dá)較穩(wěn)定。然而,沒(méi)有一個(gè)基因能在所有條件下的表達(dá)量恒定不變,因此,對(duì)于不同的物種、組織、細(xì)胞及試驗(yàn)處理選擇合適的內(nèi)參基因是十分必要的[18-26]。筆者基于青海湖裸鯉多組織RNA-seq數(shù)據(jù),篩選表達(dá)穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因,并利用GeNorm、NormFinder和BestKepper 3個(gè)程序評(píng)估上述基因在0 ℃和17 ℃時(shí),腦、肝胰臟和肌肉組織中qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性,篩選出適于青海湖裸鯉qRT-PCR分析的內(nèi)參基因,并驗(yàn)證其校正目標(biāo)基因表達(dá)量的可靠性,以期為高原魚(yú)類極端環(huán)境適應(yīng)的研究提供內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)來(lái)自青海省裸鯉救護(hù)中心。選擇體質(zhì)量(8.5±1.2) g、體長(zhǎng)(10.3±2.6) cm的青海湖裸鯉120日齡的幼魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象,每組18尾,隨機(jī)分成低溫組和對(duì)照組,各組處理設(shè)3個(gè)平行。對(duì)照組溫度為17 ℃恒溫,低溫組在17 ℃恒溫飼養(yǎng)7 d后,以0.5 ℃/h速度降溫至0 ℃,并恒溫在0 ℃飼養(yǎng)15 d,其間除了溫度差異,飼養(yǎng)密度、氧氣供給、飼喂、水體循環(huán)過(guò)濾、光照節(jié)律等均與對(duì)照組一致。處理15 d后,麻醉處理(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽),取腦、肝胰臟、肌肉等組織。將所取組織置于凍存管中,液氮中速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 候選內(nèi)參基因挖掘

利用本課題組未發(fā)表的青海湖裸鯉多組織低溫適應(yīng)的RNA-seq定量數(shù)據(jù),篩選出最符合內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)的基因。理想的內(nèi)參基因,應(yīng)該具備以下2個(gè)基本條件:(1)在目標(biāo)組織、細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá);(2)具有高于背景的表達(dá)水平[27]。因此,篩選條件為:目標(biāo)基因在各溫度處理、各組織間的FPKM值(每1 000 000單位比對(duì)片段中,比對(duì)到目的基因1000堿基單位的片段數(shù))>1,組內(nèi)變異系數(shù)<0.2。符合標(biāo)準(zhǔn)的基因利用R語(yǔ)言中NormFinder軟件包(https://www.moma.dk/files/r.NormOldStab5.txt)進(jìn)行進(jìn)一步篩選,參數(shù)設(shè)置如下:Groups=TRUE,ctVal=FALSE,pStabLim=0.25。

1.2.2 總RNA提取

剪取約50 mg凍存組織樣,放入無(wú)RNase的2 mL離心管中,加入鋼珠和800 μL組織裂解液(Trizol),在高通道組織勻漿機(jī)中以40 Hz、180 s勻漿,4 ℃、12 000 r/min (離心半徑 6.5 cm)離心2 min,保留上清液進(jìn)行總RNA提取試驗(yàn)。總RNA提取按照康為世紀(jì)Ultrapure RNA Kit (DNase I)(貨號(hào)CW0597S)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 總RNA 的檢測(cè)

利用超微量核酸蛋白測(cè)定儀Nano drop和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 樣品質(zhì)量和完整性。測(cè)定總RNA的濃度和純度;電泳檢測(cè)若28S、18S條帶清晰,則表明總RNA完整性較好,無(wú)DNA及蛋白污染,可作為反轉(zhuǎn)錄模板。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄cDNA

反轉(zhuǎn)錄使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系,各組分如下:隨機(jī)引物(10 μmol/L) 1 μL,總RNA 5 μL,2×ES Reaction Mix 10 μL,EasyScript?RT/RI Enzyme 1 μL,gDNA酶1 μL,最后用無(wú)RNA酶ddH2O將體系補(bǔ)充至20 μL。42 ℃水浴孵育1 h,合成第一鏈cDNA,95 ℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶3 min,然后12 000 r/min (離心半徑 6.5 cm)離心1 min,用5倍體積去離子水稀釋后,進(jìn)行后續(xù)qRT-PCR反應(yīng)。

1.2.5 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計(jì)

對(duì)Abhd18、Actb、B2m、Bad、Dazap2、Eloa、Fabp3和Gapdh共8個(gè)候選基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)青海湖裸鯉基因庫(kù)(未發(fā)表),利用Primer Premier 6.0軟件對(duì)上述候選基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì),標(biāo)準(zhǔn)如下:引物Tm(55±5) ℃,堿基長(zhǎng)度18～22 bp,GC 含量為40%～60%。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～200 bp,引物信息見(jiàn)表1。另外,為探討低溫下青海湖裸鯉的脂類代謝變化,對(duì)Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4等關(guān)鍵基因的表達(dá)豐度進(jìn)行檢測(cè)。

表1 基因引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.2.6 qRT-PCR

本試驗(yàn)采用SYBR Green I法qRT-PCR(相對(duì)定量)進(jìn)行mRNA表達(dá)量分析;定量PCR試劑盒為:北京全式金TransStart Green qPCR SuperMix;檢測(cè)機(jī)器為L(zhǎng)ightCycler96 RealTime PCR儀(Roche,瑞士)。20 μL反應(yīng)體系優(yōu)化如下:2×SYBR Premix EX-Taq Mix 10 μL,QF (10 μmol/L) 0.5 μL,QR (10 μmol/L) 0.5 μL,模板cDNA 2 μL,無(wú)RNA酶dH2O 7 μL。每個(gè)基因均設(shè)3個(gè)平行孔。優(yōu)化后的反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性5 s ,61 ℃退火35 s,40個(gè)循環(huán)。延伸階段收集熒光信號(hào),反應(yīng)結(jié)束后,97 ℃ 1 min獲得熔解曲線。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量分析數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法處理[28],處理軟件利用R語(yǔ)言ddCt包完成。分別采用R語(yǔ)言中NormqPCR軟件包[29]、Normfinder軟件包及endoGenes.R (https://github.com/hanielcedraz/endoGenes) 腳本文件完成GeNorm、Normfinder及BestKeeper等3種方法對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。采用獨(dú)立性t檢驗(yàn)對(duì)兩組間的相對(duì)表達(dá)量做顯著性檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。統(tǒng)計(jì)作圖由R語(yǔ)言ggplot2軟件包(https://cran.rproject.org/web/packages/ggplot2/index.html)完成。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)參基因篩選

根據(jù)多組織(腦、鰓、心、腎臟、腸道、肝胰臟、肌肉、皮膚等8個(gè)組織)RNA-seq的基因定量結(jié)果,在青海湖裸鯉所有表達(dá)的編碼基因中進(jìn)行候選內(nèi)參基因篩選。參考文獻(xiàn)[27]的方法,選擇各組織中平均log(FPKM)>1,組內(nèi)FPKM值變異系數(shù)<0.2的基因。結(jié)果共獲得7個(gè)候選內(nèi)參基因,分別是脫水酶(Abhd18)基因、肌動(dòng)蛋白(Actb)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相關(guān)蛋白(Dazap2)基因、BCL細(xì)胞死亡激動(dòng)因子(Bad)基因和脂肪酸結(jié)合蛋白3(Fabp3)基因,各基因在各組織中的RNA-seq表達(dá)定量結(jié)果見(jiàn)圖1。在候選內(nèi)參基因中,B2m和Actb基因也是其他魚(yú)類常用的內(nèi)參基因,而Fabp3基因在心臟中高表達(dá),在其他組織中表達(dá)量較穩(wěn)定,因此選作候選內(nèi)參基因擬驗(yàn)證其在腦、肝胰臟和肌肉組織中的表達(dá)穩(wěn)定性;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)基因是魚(yú)類最常用內(nèi)參基因,但因其在組內(nèi)的變異系數(shù)為0.23,大于0.2,未達(dá)到本試驗(yàn)中篩選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)。但是,考慮到Gapdh基因作為內(nèi)參基因應(yīng)用的廣泛性,同時(shí),為了更好地比較分析內(nèi)參基因?qū)Χ拷Y(jié)果的影響,筆者也把Gapdh基因作為候選內(nèi)參基因。因此最終確定8個(gè)候選內(nèi)參基因,進(jìn)行下游分析。利用NormFinder方法對(duì)候選基因按表達(dá)穩(wěn)定值排序,表達(dá)穩(wěn)定值排序見(jiàn)表2,數(shù)值越小則表達(dá)穩(wěn)定性越高。

圖1 候選基因表達(dá)量熱圖Fig.1 Heatmap of expression level of candidate genes

表2 利用NormFinder方法基于RNA-seq定量結(jié)果分析候選基因表達(dá)穩(wěn)定性Tab.2 Stability analysis of candidate genes based on RNA-seq by NormFinder

2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)

利用Nano drop測(cè)定總RNA的質(zhì)量濃度均在150 ng/μL以上,純度D(260 nm)/D(280 nm)及D(260 nm)/D(230 nm)均在2.1～2.0;隨機(jī)選取5個(gè)RNA樣品進(jìn)行核酸瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示,總RNA完整性較好,28S、18S條帶清晰,無(wú)明顯的DNA及蛋白污染,可作為反轉(zhuǎn)錄模板(圖2)。

圖2 總RNA電泳Fig.2 The agarose gel electrophoresis of total RNAM.標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1.0 ℃腦; 2.17 ℃腦; 3.0 ℃肝胰臟; 4.17 ℃肝胰臟; 5.17 ℃肌肉.M.marker; 1.brain at 0 ℃; 2.brain at 17 ℃; 3.hepatopancreas at 0 ℃; 4.hepatopancreas at 17 ℃; 5.muscle at 17 ℃.

2.3 內(nèi)參基因引物特異性驗(yàn)證

對(duì)設(shè)計(jì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),各基因的擴(kuò)增片段熔解曲線呈單一峰,表明引物特異性良好,可用于定量PCR分析。

圖3 候選內(nèi)參基因熔解曲線Fig.3 Melting curves of candidate genes

基因的表達(dá)豐度用Ct值表示,其數(shù)值越高,則表達(dá)量越低。理想的內(nèi)參基因Ct值應(yīng)大于10,且趨近于20。對(duì)青海湖裸鯉不同溫度處理下,各候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(圖4),8個(gè)基因在腦、肝胰臟及肌肉組織中的表達(dá)水平存在一定變化,其中B2m和Bad基因的表達(dá)豐度相對(duì)較高,而Abhd18和Gapdh基因表達(dá)豐度較低;Fabp3和Gapdh基因在不同溫度下組織間的表達(dá)量差異較大,B2m和Eloa基因在不同溫度下組織間的表達(dá)量差異較小。

圖4 候選基因Ct值Fig.4 Ct values of candidate genes

2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

為篩選在不同溫度和組織間均能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因,筆者利用GeNorm、Normfinder和BestKeeper方法對(duì)青海湖裸鯉在0、17 ℃條件下腦、肝胰臟及肌肉組織內(nèi)8個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行分析。

2.4.1 GeNorm分析結(jié)果

GeNorm是由Vandesompele等編寫(xiě)的專門用于確定qRT-PCR分析中,篩選最適內(nèi)參基因的程序,該方法已被引入R語(yǔ)言NormqPCR包[29]。GeNorm通過(guò)計(jì)算每個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M值來(lái)選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因。標(biāo)準(zhǔn)是M值越小,內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越好,反之,內(nèi)參基因的穩(wěn)定性越差。分析結(jié)果顯示,8個(gè)候選內(nèi)參基因在青海湖裸鯉不同溫度、不同組織間表達(dá)穩(wěn)定性排序,由高到底依次是:B2m、Eloa、Bad、Dazap2、Actb、Abhd18、Gapdh、Fabp3(圖 5)。

圖5 GeNorm方法分析候選基因穩(wěn)定值排序Fig.5 Stability value sort of candidate genes by GeNorm

GeNorm通過(guò)計(jì)算引入新的內(nèi)參基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異V值,并根據(jù)(Vn/Vn+1)值確定最優(yōu)內(nèi)參基因的數(shù)目,以減少使用單一內(nèi)參基因所引起的偏差。當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時(shí),最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)為n;如果Vn/Vn+1>0.15,則最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)為n+1。由圖6可知,V2/V3對(duì)應(yīng)變異系數(shù)最高且大于0.15,因此確定最合適的內(nèi)參組合基因數(shù)目是3個(gè)(圖6)。

圖6 GeNorm方法檢測(cè)最適內(nèi)參基因數(shù)目Fig.6 Optimal reference gene analysis by GeNorm

2.4.2 NormFinder 分析結(jié)果

NormFinder是Claus等在2004年編寫(xiě)的用于篩選內(nèi)參基因的一種程序,該程序計(jì)算原理與GeNorm程序相似,也是根據(jù)表達(dá)穩(wěn)定值篩選最適內(nèi)參基因,判定標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)穩(wěn)定值最小的基因?yàn)樽钸m內(nèi)參基因[17]。分析結(jié)果顯示,B2m基因表達(dá)最穩(wěn)定,而Fabp3基因最不穩(wěn)定(圖7)。與GeNorm方法得出的結(jié)果相似的是,B2m都是表達(dá)最穩(wěn)定的最適內(nèi)參基因,而Fabp3基因表達(dá)最不穩(wěn)定。

圖7 NormFinder方法對(duì)候選基因表達(dá)穩(wěn)定值排序Fig.7 Stability value sort of candidate genes by NormFinder

2.4.3 BestKeeper分析結(jié)果

BestKeeper是Michael等編寫(xiě)的針對(duì)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因表達(dá)量分析的程序,該程序通過(guò)計(jì)算基因間相關(guān)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),再比較各值的大小,最終確定最適內(nèi)參基因[30]。判定原則為相關(guān)系數(shù)越大、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小,內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好,反之,穩(wěn)定性越差;當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)差>1時(shí),則該內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定。分析結(jié)果(表3)顯示,只有B2m、Eloa基因的標(biāo)準(zhǔn)差小于1,且變異系數(shù)最小,分別為2.109、2.555,相關(guān)系數(shù)均大于0.85,綜合得出B2m和Eloa基因表達(dá)最穩(wěn)定,最適宜作青海湖裸鯉低溫脅迫的內(nèi)參基因,而Fabp3基因在8個(gè)候選基因中表達(dá)穩(wěn)定性最差,不宜選為內(nèi)參基因。

表3 NormFinder方法分析候選基因表達(dá)穩(wěn)定性Tab.3 Stability analysis of candidate gene by NormFinder

2.5 相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果

綜合GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3種方法分析的結(jié)果,可確定B2m是青海湖裸鯉低溫適應(yīng)過(guò)程中多組織轉(zhuǎn)錄定量的最適內(nèi)參基因。為了進(jìn)一步比較分析內(nèi)參基因在相對(duì)定量分析中的可靠性,利用R語(yǔ)言ddCt包,分別以8個(gè)候選內(nèi)參基因中的1個(gè)作內(nèi)參基因,對(duì)其余7個(gè)基因在不同溫度和不同組織間的表達(dá)情況進(jìn)行相對(duì)定量。根據(jù)相對(duì)定量結(jié)果,比較各基因在青海湖裸鯉0 ℃和17 ℃處理后各組織中的表達(dá)差異倍數(shù),并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。分析結(jié)果顯示,以Eloa、B2m做內(nèi)參基因時(shí),各基因qRT-PCR相對(duì)定量的結(jié)果的相關(guān)性最高,r2分別達(dá)到0.95及0.89,表明以Eloa、B2m為內(nèi)參基因的相對(duì)定量結(jié)果更可靠,可信度更高(圖8)。同時(shí),Eloa、B2m也是GeNorm及BestKeeper方法共同分析獲得的最適內(nèi)參基因。

2.6 低溫適應(yīng)相關(guān)基因qRT-PCR分析

根據(jù)多種方法最終篩選獲得在不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定的基因?yàn)镋loa和B2m,以上述2個(gè)基因作為內(nèi)參基因,對(duì)青海湖裸鯉幼魚(yú)低溫適應(yīng)脂肪酸代謝途徑中的關(guān)鍵基因長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(Acsl1)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a(Cpt1a)、超長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶(Elovl1)和溶質(zhì)載體蛋白27a4(Slc27a4)在不同溫度下腦、肝胰臟和肌肉組織中的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明,以Eloa和B2m作為雙內(nèi)參基因進(jìn)行2-△△Ct法相對(duì)定量分析,4個(gè)目標(biāo)基因在低溫條件下肝胰臟和肌肉組織中的表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01),在肝胰臟中的表達(dá)量最高;在腦組織中Acsl1a基因在低溫條件下顯著上調(diào)(P<0.01),Cpt1a、Elovl1和Slc27a4基因表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖9a)。4個(gè)目標(biāo)基因在低溫(0 ℃)與適溫(17 ℃)的相對(duì)表達(dá)比值與RNAseq的差異表達(dá)倍數(shù)的相關(guān)性較高,r2均大于0.87(圖9b)。

3 討 論

3.1 候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

qRT-PCR技術(shù)因其靈敏、高效、精確、廉價(jià)的特點(diǎn),是研究基因表達(dá)豐度最常用的方法,已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因功能的研究中。但是,在試驗(yàn)過(guò)程中的誤差會(huì)影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此,需要一個(gè)或多個(gè)已知的表達(dá)穩(wěn)定的基因來(lái)校正試驗(yàn)誤差。水生生物常用的內(nèi)參基因包括:Act-β[18]、Gapdh[19]、Ef-1α[20-21]、Rpl13[22]、Sdha[23]、HPRT1[24]和18S rRNA[21]等。在功能上,內(nèi)參基因多參與機(jī)體的基礎(chǔ)代謝或是細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)組成成分,例如Act-β基因編碼的肌動(dòng)蛋白是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要蛋白之一[18],Rpl13基因編碼的核糖體蛋白以及18S rRNA基因編碼核糖體小亞基RNA[22,25]是構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)核糖體的主要成分之一,Gapdh基因編碼的甘油酸-3-磷酸脫氫酶是參與糖酵解活動(dòng)的關(guān)鍵酶[19],Ef-1α基因編碼的延伸因子參與調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯、折疊[20],Sdha基因編碼的琥珀酸脫氫酶亞基A是線粒體內(nèi)膜的結(jié)合酶,能夠調(diào)控線粒體的氧化磷酸化和呼吸鏈的電子傳遞過(guò)程[23],HPRT1基因編碼次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸的合成[24]。然而,基因的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,沒(méi)有一個(gè)基因的表達(dá)水平能夠在不同物種、器官、組織、細(xì)胞,或在不同時(shí)間、發(fā)育階段、生理狀態(tài)、病理過(guò)程,或在不同環(huán)境和試驗(yàn)處理下保持恒定。Casadei等[18]在對(duì)斑馬魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的多個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn),bactin2和Ef-1-α在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性最高;孫海成等[22]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)比較了尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)7個(gè)候選內(nèi)參基因在多個(gè)健康組織中的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Rpl13在不同組織中的表達(dá)較為穩(wěn)定;費(fèi)越越等[15]對(duì)不同處理?xiàng)l件下異育銀鯽組織和尾鰭細(xì)胞的4個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Act-β和Ef-1α基因在健康異育銀鯽的多組織中表達(dá)較為穩(wěn)定,而在鯉皰疹病毒Ⅱ型感染條件下,Act-β基因在腎臟和尾鰭細(xì)胞中的表達(dá)最為穩(wěn)定,Ef-1α基因在脾臟中的表達(dá)最為穩(wěn)定。

為挖掘適用于青海湖裸鯉低溫適應(yīng)過(guò)程中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因,筆者以青海湖裸鯉不同溫度處理的多組織RNA-seq數(shù)據(jù)為依據(jù),篩選得到8個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因Abhd18、Actb、B2m、Bad、Eloa、Dazap2、Fabp3、Gapdh。其中Actb、B2m和Gapdh基因是水生生物常用的內(nèi)參基因。通過(guò)qRT-PCR對(duì)其在不同溫度條件下,青海湖裸鯉腦、肝胰臟和肌肉組織的表達(dá)豐度進(jìn)行檢測(cè)。利用Genorm、Normfinder和BestKeeper 3種方法對(duì)上述8個(gè)候選基因在青海湖裸鯉中的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析。根據(jù)各軟件評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[17,24-29],綜合3個(gè)軟件分析的結(jié)果,最終篩選出最符合要求的內(nèi)參基因。3個(gè)軟件的分析結(jié)果表明,在青海湖裸鯉幼魚(yú)不同溫度適應(yīng)下腦、肝胰臟、肌肉組織中表達(dá)最穩(wěn)定的基因是B2m和Eloa基因,3種方法分析結(jié)果均顯示,Fabp3基因的穩(wěn)定性較差,說(shuō)明該基因不適合作為青海湖裸鯉的內(nèi)參基因。微球蛋白-β2(B2m)是由淋巴細(xì)胞、血小板、多形核白細(xì)胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白,生理狀態(tài)下B2m在多種細(xì)胞內(nèi)的含量很穩(wěn)定,其編碼基因B2m是qRT-PCR分子中常用的內(nèi)參之一,在鱖(Sinipercachuatsi)[31]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[32]等魚(yú)類的分子生物學(xué)研究中被用作qRT-PCR分析的內(nèi)參基因。轉(zhuǎn)錄延伸蛋白A(Eloa),是一種轉(zhuǎn)錄因子,具有多種生物學(xué)活性,廣泛存在于多種細(xì)胞核基因內(nèi)[33],目前尚無(wú)關(guān)于Eloa基因作為內(nèi)參基因的報(bào)道。筆者發(fā)現(xiàn),Eloa基因在青海湖裸鯉不同組織和不同溫度處理下的表達(dá)量均較穩(wěn)定,是潛在的新的候選內(nèi)參基因。另外,Gapdh基因也是動(dòng)植物常用的內(nèi)參基因[18],然而在本試驗(yàn)中,通過(guò)對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)的篩選及qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證,Gapdh基因在青海湖裸鯉幼魚(yú)不同的組織和溫度脅迫下的表達(dá)差異較大,對(duì)低溫較為敏感。

3.2 低溫對(duì)內(nèi)參基因表達(dá)的影響

魚(yú)類是變溫動(dòng)物,由于缺乏體溫調(diào)控能力,其生存對(duì)環(huán)境溫度的依賴極高。不同于其他環(huán)境因素,溫度對(duì)魚(yú)類生理活動(dòng)的影響是廣泛的[34]。由已有的研究報(bào)道可知,溫度能顯著影響魚(yú)類多組織、多基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)[7,35-37]。筆者通過(guò)分析青海湖裸鯉對(duì)低溫響應(yīng)的RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):在其他魚(yú)類研究中常用的內(nèi)參基因,如Ef-1[20-21]、Rpl13[22]、Sdha[23]、HPRT1[24]基因等,在青海湖裸鯉幼魚(yú)0 ℃低溫條件下的多組織中的表達(dá)量降低,不同溫度間(17 ℃和0 ℃)或不同組織間的變異系數(shù)>0.2,不能滿足內(nèi)參基因的篩選標(biāo)準(zhǔn);而B(niǎo)ad、Eloa、Dazap2等基因的表達(dá)豐度受溫度影響較小,是潛在的候選內(nèi)參基因。Long等[38]在鯉對(duì)低溫脅迫下腦、心肌等組織的分子響應(yīng)中發(fā)現(xiàn),Ef-1基因在不同溫度及不同組織間的表達(dá)量較為穩(wěn)定,可作為內(nèi)參基因;而徐麗華等[7]在研究鯉腦組織低溫差異表達(dá)候選基因時(shí),選擇了18S rRNA基因作內(nèi)參基因。上述關(guān)于魚(yú)類低溫適應(yīng)的分子研究篩選的內(nèi)參基因與本試驗(yàn)有所差異,可能的原因是,雖然青海湖裸鯉和鯉都屬鯉科魚(yú)類,但二者對(duì)低溫環(huán)境的耐受能力不同,對(duì)低溫脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制有差異,同源基因的表達(dá)模式具有物種特異性。

除了內(nèi)參基因的表達(dá)活動(dòng)受到溫度的影響外,耐低溫魚(yú)類參與脂類代謝過(guò)程的基因也普遍受到低溫脅迫的調(diào)控。例如:在低溫條件下,鯉腦組織中的脂肪酸鏈延伸蛋白、酰基輔酶A脫氫酶、肌醇-1-磷酸合成酶等基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)[7];鯉心臟中Acsl1b、Acsl4a、Elovl5以及PPAR信號(hào)通路基因表達(dá)顯著上調(diào)[38]。本試驗(yàn)中,對(duì)參與脂肪酸代謝過(guò)程中的Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4等4個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行分析,上述基因在0 ℃時(shí)肝胰臟和肌肉組織表達(dá)量均顯著上調(diào),其結(jié)果與徐麗華等[7,38]對(duì)鯉的研究一致。Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4基因分別是參與長(zhǎng)鏈脂肪酸活化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸鏈延伸和脂肪酸β氧化過(guò)程的關(guān)鍵基因,其在低溫環(huán)境下的高表達(dá)模式表明青海湖裸鯉幼魚(yú)在低溫環(huán)境下脂肪酸的代謝活動(dòng)增強(qiáng)。脂肪酸是魚(yú)類主要能源物質(zhì)和膜結(jié)構(gòu)組分,耐寒魚(yú)類在低溫環(huán)境下通過(guò)提高脂肪酸氧化獲能應(yīng)對(duì)低溫下的能量消耗[36];并且通過(guò)改變細(xì)胞膜組分、增加磷脂不飽和脂肪酸含量,以改善膜流動(dòng)性及僵化,避免細(xì)胞組織受到低溫?fù)p害[7]。青海湖裸鯉的物種形成與青藏高原海拔的抬升、青海湖的形成密切相關(guān)[2],隨著棲息地海拔的升高、溫度逐漸降低,青海湖裸鯉也演化出復(fù)雜的耐低溫機(jī)制以應(yīng)對(duì)高寒的氣候條件。已有研究表明,青海湖裸鯉多種能量代謝相關(guān)基因發(fā)生了大規(guī)模擴(kuò)張事件[39],這也暗示著青海湖裸鯉可能進(jìn)化出特殊的能量代謝過(guò)程以應(yīng)對(duì)低溫環(huán)境對(duì)能量的需求。

另外,本試驗(yàn)中使用的3種方法均已編譯成R語(yǔ)言中的軟件包或腳本文件,而相似的研究大多采用的是Excel中相應(yīng)的3種分析插件。相比于后者,R語(yǔ)言的數(shù)據(jù)處理能力更強(qiáng),更適用于處理RNA-seq等體量較大的數(shù)據(jù);且R語(yǔ)言軟件包均為開(kāi)源程序,調(diào)用更靈活、高效,適于批量自動(dòng)化的分析工作,具有更廣泛的應(yīng)用前景。

4 結(jié) 論

筆者基于GeNorm、NormFinder、BestKeeper 3種方法評(píng)估了Abhd18、Actb、B2m、Bad、Eloa、Dazap2、Fabp3和Gapdh共8個(gè)候選內(nèi)參基因在青海湖裸鯉低溫脅迫下多個(gè)組織中的表達(dá)穩(wěn)定性,篩選并驗(yàn)證得到2個(gè)最適內(nèi)參基因B2m和Eloa。以B2m和Eloa作為雙內(nèi)參基因?qū)η嗪：沲幹惔x調(diào)控基因Acsl1、Cpt1a、Elovl1和Slc27a4在不同溫度下腦、肝胰臟和肌肉組織中的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果顯示,4個(gè)目標(biāo)基因低溫與適溫的相對(duì)表達(dá)比值與RNAseq的差異表達(dá)倍數(shù)高度正相關(guān),說(shuō)明qRT-PCR定量結(jié)果可靠。試驗(yàn)結(jié)果可為高原魚(yú)類耐逆分子生物學(xué)的研究及內(nèi)參基因的選擇提供科學(xué)依據(jù)。