姜黃素對大口黑鱸生長性能和非特異性免疫的影響

張美彥,楊 星,姜再勝,趙 鳳,李松艷,劉婷婷,張芷欣,商寶娣

( 1.貴州省農業科學院 水產研究所,貴州 貴陽 550025; 2.貴州省特種水產工程技術中心,貴州 貴陽 550025; 3.安徽省宣城市宣州區農業農村局水產技術推廣站,安徽 宣城 242000; 4.貴州師范學院,貴州 貴陽 550018 )

隨著水產養殖業不斷發展,集約化程度不斷提高,養殖規模不斷擴大,環境污染加劇,水產養殖病害時常發生,病種不斷增多,抗生素的濫用導致養殖水體惡化,細菌產生耐藥性[1],對生態環境和食物鏈的健康產生不利影響。雖然接種疫苗可以預防疾病的發生,但養殖對象個體量極大、接種程序復雜、病原體特異性差異較大、成本高等因素,限制了疫苗在水產養殖中的應用[2]。由于抗生素的禁用與疫苗的局限性,亟需一種安全、能防病且成本較低的中草藥類來保障水產養殖對象的健康。姜黃素是一種極具生理活性的物質,主要從植物莪術、姜黃、郁金等中提取。姜黃素包含了2個鄰甲基化的酚以及1個β-二酮功能基團,這種結構特性與其多種生物活性作用都高度相關[3],具有抗氧化、抗炎、消除自由基、增強免疫、促進消化等作用[4-5]。姜黃素在水產養殖中的研究相對較少,已有的研究也表明,姜黃素能促進尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)等的生長,提高其消化酶活性,促進魚體免疫調節等[6]。

大口黑鱸(Micropterussalmoides),又稱加州鱸,屬鱸形目鱸亞目太陽魚科黑鱸屬,具有生長快、肉質鮮美、經濟效益高等特點,是我國水產養殖主要品種之一[7-8]。近幾年,隨著大口黑鱸養殖集約化程度的提高,傳染性疾病暴發的情況頻發[9],尤其在魚苗養殖階段更易受到多種因素影響,造成魚體發病和死亡,影響養殖的經濟效益。

筆者以大口黑鱸為研究對象,在飼料中添加不同含量的姜黃素,通過對大口黑鱸生長和非特異性免疫及相關抗氧化指標的影響,綜合評定姜黃素對大口黑鱸的作用,旨在探明姜黃素對大口黑鱸生長及免疫機能的影響,并為開發大口黑鱸健康養殖的免疫增強劑提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 飼料配方

采用單因子試驗設計,在飼料中添加不同水平的姜黃素,共配制出6組基礎飼料。姜黃素購自河南中大生物工程有限公司,純度>98%。1～6號基礎日糧(表1)中姜黃素的添加量為0(對照組)、15、30、60、120 mg/kg和240 mg/kg。各種原料粉碎后過80目篩網,制作普通硬顆粒飼料(粒徑1.5 mm),自然風干,保存于-20 ℃冰箱待用。

表1 試驗飼料組成及營養水平(風干基礎) %Tab.1 Formulation and proximate composition of the basal diet (air-dry basis)

1.2 試驗用魚及養殖管理

大口黑鱸苗種來自貴州省水產研究所試驗基地。選擇540尾體表無傷痕、規格一致,平均體質量(4.17±0.39) g的健康苗種,于18個直徑720 mm×高600 mm的室內可控溫循環水圓形水族桶中進行飼養,每桶30尾,每組3個平行,日投喂3次(8:20—9:00、11:30—12:10和16:50—17:30),日投餌量約為魚體質量的4%,每日排污清洗水族桶1次。循環水系統日夜連續循環并充氣增氧,飼養期間pH 7.0～7.9、溫度(18±1) ℃、總氮<0.05 mg/L、溶解氧>5 mg/L、鹽度<0.05、硫化氫<0.01 mg/L。60 d養殖試驗過程中應保持環境安靜,盡量減小環境應激。

1.3 樣品采集與處理

養殖試驗開始前,測定每組大口黑鱸平均體質量;試驗結束后,禁食24 h,將試驗魚放入間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(200 mg/L)麻醉劑溶液中,70 s后撈出,置于濕毛巾上。每個桶取3尾魚,心臟取血(剪開肌肉,找到心臟下方三角形的膜狀區域,從中間向左下方扎針,取血)。每3尾魚的血液作為一個獨立的樣本,其中取50 μL血液用于呼吸爆發活性測定,20 μL血液用于血細胞計數,剩余部分血液置于EDTA抗凝管中以4 ℃、2000 r/min(離心半徑20 cm)離心30 min制備血清,用于檢測生化指標,-80 ℃凍存備用。測量魚體體質量和體長,解剖,并取內臟和肝臟分別稱量質量,將肝臟組織存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 指標測定方法

1.4.1 生長指標

養殖試驗開始前,測定每組大口黑鱸平均體質量;試驗結束后,測定大口黑鱸飼料系數(RFC)、質量增加率(wWGR,%)、特定生長率(RSG,%/d)、成活率(RS,%)、肝體指數(wHSI,%)和臟體指數(wVSI,%),按下式計算:

RFC=mF/(mt-m0)

(1)

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

(2)

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

(3)

RS=nf/ni×100%

(4)

wHSI=mh/mb×100%

(5)

wVSI=mv/mb×100%

(6)

式中,m0為魚初始體質量(g),mt為魚終末體質量(g),mF為飼料攝入量(g),t為飼喂時間(d),ni為初始魚數量(尾),nf為終末魚數量(尾),mb為樣品魚體質量(g),mh為樣品魚肝臟質量(g),mv為樣品魚內臟質量(g)。

1.4.2 血液常規參數

血紅蛋白濃度、紅細胞和白細胞密度利用深圳邁瑞全自動五分類動物血液細胞分析儀(BC-5300 VEt)進行測定。試劑盒購于深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.4.3 血液生化指標

總蛋白采用比色法,白蛋白采用溴甲酚綠法,乳酸脫氫酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活性采用國際臨床化學聯合會制定的分析測定參考方法(IFCC),由深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司提供試劑盒,在邁瑞BS-400全自動生化分析儀上測定。

1.4.4 血細胞呼吸爆發活性

血細胞呼吸爆發活性的測定參照文獻[6]的方法,略加修改進行測定。取抗凝全血50 μL,加入2′,7′-二氯熒光素雙乙酸鹽,使其終濃度為1 μmol/L,避光孵育30 min后,200目篩網過濾,用多功能酶標儀,激發485 nm,發射535 nm,測定其熒光值。2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽穿過細胞膜進入細胞后,被酯酶水解生成二氯二氫熒光素,二氯二氫熒光素不能穿透細胞膜,就被留在細胞內,細胞內的活性氧氧化無熒光的二氯二氫熒光素生成有熒光的二氯熒光素。二氯熒光素的平均熒光量可代表呼吸爆發活性。

1.4.5 白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α活性的測定

肝臟中白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的活性主要是通過雙抗體夾心法來測定,采用購于IBL(德國)公司的白細胞介素-1β Elisa檢測試劑盒和腫瘤壞死因子-α ELISA檢測試劑盒完成測定。

1.4.6 補體替代途徑溶血(ACH50)活性測定

補體替代途徑溶血活性主要參照文獻[10-11]的方法,略加修改進行測定。將血清和乙二醇雙氨基四乙酸-Mg2+-明膠巴比妥緩沖液按不同比例混合,加入0.1 mL紅細胞,在25 ℃水浴下孵育90 min后,4000 r/min離心(離心半徑20 cm)10 min,取上清液,測吸光度(414 nm),計算各管修正值,算出溶血率為50%所需稀釋補體的體積(mL),換算出的濃度補體量,即為1個ACH50單位。

1.4.7 肝臟中抗氧化蛋白基因的相對表達水平測定

抗氧化蛋白基因的表達水平測定方法與文獻[12]的方法相似,各引物信息見表2。應用2-ΔΔCt法,基準為60 mg/kg姜黃素添加組的基因表達水平。

表2 PrxⅠ、PrxⅡ、PrxⅢ、PrxⅣ、PrxⅤ、PrxⅥ基因熒光定量PCR引物Tab.2 Primers for real time PCR analysis of PrxⅠ, PrxⅡ, PrxⅢ, PrxⅣ, PrxⅤ, and PrxⅥ genes

1.5 數據處理

試驗數據用SPSS 17.0軟件進行統計分析。用單因子方差分析及鄧肯多重比較檢驗各試驗組間差異顯著性,P<0.05為差異顯著,數據用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 姜黃素對大口黑鱸生長及形體指標的影響

經過60 d的養殖試驗(表3),隨著姜黃素含量的升高,大口黑鱸質量增加率及特定生長率先升后降。60 mg/kg的姜黃素顯著提高了大口黑鱸的質量增加率及特定生長率(P<0.05)。60 mg/kg姜黃素組飼料系數最低,顯著低于對照組(P<0.05)。同時,各組間魚體肝體指數、臟體指數及存活率差異不顯著(P>0.05)。

表3 姜黃素對大口黑鱸生長性能和形體指標的影響Tab.3 Effects of curcumin on growth performance of largemouth bass M. salmoides

2.2 姜黃素對大口黑鱸血液指標的影響

白細胞密度隨著姜黃素含量的增加呈先升后降的趨勢,30 mg/kg和60 mg/kg姜黃素組白細胞數顯著增加(P<0.05)(表4)。此外,各組間魚體血紅蛋白質量濃度及血紅細胞數差異不顯著(P>0.05)。

表4 姜黃素對大口黑鱸血液指標的影響Tab.4 Effects of curcumin on haematological analyses of largemouth bass M. salmoides

2.3 姜黃素對大口黑鱸生理生化指標的影響

隨著姜黃素添加量的增多,大口黑鱸谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶活性呈先降后升的趨勢,60 mg/kg姜黃素顯著降低了谷丙轉氨酶活性(P<0.05),30 mg/kg和60 mg/kg組谷草轉氨酶活性顯著低于對照組(P<0.05);30 mg/kg和60 mg/kg姜黃素但大口黑鱸白蛋白質量濃度較高(表5)。而各組間魚體總蛋白、乳酸脫氫酶、球蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 姜黃素對大口黑鱸生理生化指標的影響Tab.5 Effects of curcumin on biochemical indices of largemouth bass M. salmoides

2.4 姜黃素對大口黑鱸非特異性免疫指標的影響

各組之間細胞呼吸爆發活性差異不顯著(P>0.05)(圖1);各組添加的姜黃素均顯著提高了腫瘤壞死因子-α的活性(P<0.05)(圖2);60 mg/kg姜黃素顯著提高了白細胞介素-1β活性(P<0.05)(圖3);30、60 mg/kg和120 mg/kg姜黃素顯著提高了補體替代途徑活性(P<0.05)(圖4)。

圖1 姜黃素對大口黑鱸呼吸爆發活性的影響Fig.1 Effects of curcumin on respiratory burst activity of largemouth bass M. salmoides

圖2 姜黃素對大口黑鱸腫瘤壞死因子-α活性的影響Fig.2 Effects of curcumin on TNF-α activity of largemouth bass M. salmoides

圖3 姜黃素對大口黑鱸白細胞介素-1β活性的影響Fig.3 Effects of curcumin on IL-1β activity of largemouth bass M. salmoides

圖4 姜黃素對大口黑鱸補體替代途徑活性的影響Fig.4 Effects of curcumin on ACH50 activity of largemouth bass M. salmoides

2.5 姜黃素對大口黑鱸抗氧化蛋白基因的影響

和對照組相比,60、120 mg/kg和240 mg/kg姜黃素顯著提高了肝臟中PrxⅠ基因的表達水平(P<0.05)(圖5a);60 mg/kg和120 mg/kg姜黃素顯著提高了肝臟中PrxⅡ基因的表達水平(P<0.05)(圖5b);與對照組相比,各組姜黃素均顯著提高了PrxⅣ、PrxⅤ基因表達水平(P<0.05)(圖5d、5e);15、30 mg/kg和60 mg/kg姜黃素顯著提高了PrxⅥ基因的表達水平(P<0.05)(圖5f)。

圖5 姜黃素對大口黑鱸Prx mRNA表達水平的影響Fig.5 Effects of curcumin on relative expression level of Prx mRNA of largemouth bass M. salmoides

3 討 論

3.1 姜黃素對大口黑鱸生長性能的影響

在對尼羅羅非魚等的研究中發現,姜黃素可以通過提高腸道消化酶活性,促進吸收飼料中的營養物質,從而提高飼料利用率[6]。本試驗結果顯示,在大口黑鱸日糧中添加60 mg/kg的姜黃素,可顯著提高大口黑鱸特定生長率和質量增加率,降低餌料系數。其原因應該是日糧中60 mg/kg的姜黃素,提高了腸道內的消化酶活性,日糧中的營養物質能被更好地消化吸收,從而提高了大口黑鱸的特定生長率和質量增加率,這與對大鼠[13]、小鼠[14]、尼羅羅非魚[6]等的研究結果一致。

日糧中過量添加姜黃素對大口黑鱸生長性能產生不良影響。這與對羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[15]、建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)[16]、尼羅羅非魚[17]的研究報道一致。過量添加姜黃素產生不利影響的原因可能是:過量添加會導致飼料適口性變差,影響養殖對象攝食水平;也可能與過量的姜黃素促氧化作用有關[18];另外,姜黃素還會對腸道菌群有負面影響,從而影響消化吸收。此外,姜黃素添加水平對大口黑鱸肝體指數、臟體指數、存活率和肥滿度無顯著影響,說明姜黃素是一種低毒的優質膳食補充劑,此結果與胡忠澤等[19-20]關于姜黃素化學成分和毒性研究結果一致。

3.2 姜黃素對大口黑鱸血液及生理生化指標的影響

血液生化指標檢測已廣泛應用于水產養殖研究中。其中,白細胞作為血液中消除有害微生物的第一道防線,被認為是非特異性免疫中最主要的物質之一,是機體免疫功能和健康狀況正常與否的重要指標。本試驗中,添加60 mg/kg的姜黃素顯著提高了大口黑鱸血液中白細胞數量,這與在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]上的研究結果相同,說明姜黃素可能會刺激機體產生免疫反應,從而提高機體免疫功能。本試驗中,各組血紅蛋白含量和紅細胞數無顯著差異,這與對虹鱒、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)[22-23]的研究結果不同,可能是因為不同物種、不同養殖密度、不同養殖階段、不同姜黃素添加量等都會對試驗結果產生差異,具體的反應機制還需進一步研究。

白蛋白及總蛋白含量增加表明機體的先天免疫功能增強[22,24]。本試驗中,添加姜黃素提高了大口黑鱸血清中白蛋白含量,這與對尖吻鱸(Latescalcarifer)[25]的研究結果一致。一般來說,谷丙轉氨酶活性增加說明肝臟受到一定程度損傷[26],大口黑鱸日糧中添加60 mg/kg姜黃素降低了血清中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性,與在草魚(Ctenopharyngodonidella)[27]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[28]、尼羅羅非魚[29]中的變化趨勢一致。這表明適當添加姜黃素可降低血清中的轉氨酶活性,對肝臟有一定的保護作用。這可能與姜黃素中具有的二酮和酚羥基基團有關,這種特有結構能夠有效清除氧化自由基,提高機體的抗氧化能力[30],保護肝臟。

3.3 姜黃素對大口黑鱸炎癥因子的影響

呼吸爆發又稱為氧爆發,是再灌注時自由基生成的重要途徑之一,也是機體免疫反應的重要組成部分。本試驗結果表明,60 mg/kg姜黃素可提高大口黑鱸的細胞呼吸爆發活性,這與對團頭魴[31]的研究結果一致。白細胞介素-1β是機體發生炎癥反應的重要介質,在本試驗中飼料添加60 mg/kg姜黃素顯著提高了白細胞介素-1β活性。但有相關研究報道,姜黃素對細胞中的白細胞介素-1β表達有抑制作用[32]。大部分機體的肝臟受損均可能會刺激誘導細胞產生腫瘤壞死因子-α,以清除受損肝細胞并促進細胞發生愈合反應[33]。魚體中腫瘤壞死因子-α是由白細胞產生的活化因子,能夠改善呼吸爆發活性、激發巨噬細胞吞噬活性[34],這也與本試驗中的白細胞含量增高相符。本試驗中,隨著姜黃素含量的增加,白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α活性升高。腫瘤壞死因子-α是典型的促炎因子,機體在應激狀態下發生內分泌紊亂和激素水平的異常,也會使機體腫瘤壞死因子-α活性升高[35]。肝臟白細胞介素-1β具有廣泛的免疫調節作用,能夠分泌免疫球蛋白及介導炎癥反應等[36]。因本試驗中大口黑鱸的白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α與其他報道的變化趨勢不同,故大膽推測可能是大口黑鱸有炎癥或是有其他應激反應,具體的原因還需要進一步的研究。補體替代途徑是機體中關鍵的殺菌機制[37],本試驗結果顯示,補體替代途徑溶血活性在60 mg/kg姜黃素組顯著增強。以上結果表明,姜黃素可有效緩解肝臟炎癥。可能的原因是:姜黃素通過抑制一氧化碳和活性氧信號的釋放,從而減少中性粒細胞的滲漏[38];直接調控巨噬細胞或抑制核轉錄因子信號通路,減少了炎癥因子的釋放,從而緩解炎癥反應[39]。

3.4 姜黃素對大口黑鱸抗氧化蛋白基因表達的影響

Prx是一類常見的過氧化物酶,共有6個成員,分別為PrxⅠ、PrxⅡ、PrxⅢ、PrxⅣ、PrxⅤ、PrxⅥ,均具有清除細胞中過多氧自由基的作用,可以將細胞中過多的過氧化氫還原為水,從而清除機體內過多的活性氧分子[40]。本試驗中,隨著大口黑鱸飼料中姜黃素添加水平的不斷提高,抗氧化蛋白基因表達水平均呈現先升后降的趨勢,表明一定水平的姜黃素可提高大口黑鱸肝臟的抗氧化功能,并且添加60 mg/kg的姜黃素效果最為顯著。可能的原因是:姜黃素結構中的酚羥基基團能夠清除自由基,有利于機體對過氧化氫、活性氧和脂質氫過氧化物等的清除,從而間接降低了脂質過氧化損傷[41]。

4 結 論

綜上所述,大口黑鱸日糧中適當添加姜黃素能顯著提高魚體生長性能、免疫功能和抗氧化水平,降低炎癥因子水平,且日糧中60 mg/kg姜黃素添加量為大口黑鱸的最適添加水平。