中國明對蝦BMP-7基因的克隆及表達模式分析

高 娜,盧 霞,閆允君,孔 杰,孟憲紅,李旭鵬,隋 娟,陳寶龍,曹寶祥,高 煥,欒 生

( 1.江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院,江蘇省海洋生物技術重點試驗室,江蘇 連云港 222005; 2.中國水產科學研究院 黃海水產研究所,農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室,山東 青島 266071; 3.青島海洋科學與技術國家實驗室,海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室,山東 青島 266071; 4.中國科學院 煙臺海岸帶研究所,沿海生物資源高效利用研究開發中心,山東 煙臺 264003 )

動物肌肉的發生過程主要處于胚胎發育時期內,是在一系列基因復雜而精確的調控下進行的[1-2]。近年來,DNA重組、基因敲除等多種技術的廣泛應用,使得胚胎肌肉生成的分子調控機制研究取得了極大的進展。轉化生長因子-β(TGF-β)是一類龐大的調控動物肌肉生長發育的超家族,該家族中的多個基因已被證實與肌肉發育有直接或間接的關系。骨形態發生蛋白(BMP)是從牛骨中分離的TGF-β超家族中的一員[3],可以啟動從軟骨形成到頭骨形成的過程[4]。截至目前,骨形態發生蛋白已被證明是一種多功能分泌信號蛋白,對各種細胞類型包括單核細胞[5-7]、上皮細胞[8]、間充質細胞[9]、神經細胞[10]均有廣泛的生物學活性。骨形態發生蛋白調節這些細胞的生長分化,并在各種組織和器官的形態形成中發揮關鍵作用[11]。對脊椎動物骨形態發生蛋白家族的研究較多,如:褚建新等[12]發現,給正常小鼠大腿肌肉內植入rh-BMP-2基因后,可以激活自身肌肉間質細胞間接拯救骨髓衰竭;有研究證明,BMP-2基因間接參與了爪蟾(Xenopus)肌肉發生的起始特化過程[13]。近年來,一些無脊椎動物如棘皮動物[14-15]、節肢動物[16-17]、軟體動物[18-20]等的骨形態發生蛋白家族成員也逐漸被克隆成功,發現其功能與脊椎動物的功能相似。

中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)是黃、渤海區域的特有種類,肉質鮮嫩,具有較高的經濟價值,歷史最高產量達到2.0×105t;但由于過度捕撈和環境惡化,其野生資源急劇減少,國內養殖產量遠遠不能滿足市場的需求[21-23]。生長速度是決定養殖產量最為重要的經濟性狀之一。骨形態發生蛋白是動物肌肉生長發育的重要調節因子,在脊椎動物及某些無脊椎動物的生長細胞中起關鍵作用。然而,關于骨形態發生蛋白調控中國明對蝦肌肉發生和生長的研究尚未見相關報道。筆者克隆了中國明對蝦骨形態發生蛋白家族中的BMP-7基因成員,通過實時熒光定量PCR (qRT-PCR)技術分析了FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體不同發育時期和生長速度差異顯著的幼蝦不同組織中的表達規律,為進一步解析中國明對蝦肌肉發生發育的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用中國明對蝦樣本均來自農業農村部(青島)海水養殖遺傳育種中心第13代選育群體。中國明對蝦幼體不同發育階段取樣:分別從胚胎發育階段的原腸期和4個幼體發育階段無節幼體期、溞狀幼體期、糠蝦幼體期和仔蝦期采集10尾家系樣本,每個階段每個家系取50～60尾混合為1個樣本,其中大部分內容物為肌肉。取幼蝦期同一家系的2種規格[(3.95±0.08) g和 (1.55±0.12) g]各10尾蝦的不同組織部位(心臟、鰓、肝胰腺、胃、腸道、肌肉、步足和游泳足),放入凍存管立即加入液氮后-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成

利用Trizol法提取以上樣品的總RNA,通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,用分光光度計檢測RNA濃度。采用HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)逆轉錄試劑盒(Vazyme,南京)合成第1鏈cDNA,-20 ℃保存。

1.2.2 FcBMP-7基因的克隆

在中國明對蝦的轉錄組測序數據篩選到BMP-7基因部分cDNA片段。根據已知序列設計5′RACE和3′RACE特異性引物,設計原則參照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends version 2.0 (Invitrogen,美國)和SMARTer?RACE 3′ Kit (Clontech,美國)試劑盒的說明書(表1)。

1.2.3 FcBMP-7蛋白的生物信息學分析

利用BioEdit軟件將3′RACE和5′RACE擴增片段與已知序列進行拼接,獲得FcBMP-7基因的cDNA全長序列。通過DNAMAN 8.0翻譯氨基酸序列;利用BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行預測蛋白序列的同源性比對;通過Protparam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)預測蛋白的等電點和分子質量;采用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)查找糖基化位點;通過NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)查找磷酸化位點;利用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行氨基酸序列的比對;基于MEGA 7.0的鄰接法構建系統進化樹(自展值為1000)。

1.2.4 FcBMP-7基因的表達模式分析

以18S rRNA為內參基因,通過實時熒光定量PCR檢測FcBMP-7基因在不同發育時期、不同生長速率的2組蝦的不同組織中的轉錄水平,反應體系和反應條件參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Vazyme,南京)說明書進行。利用2-△△Ct方法[24]計算FcBMP-7基因的相對表達量。試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 試驗所用引物序列Tab.1 The primer sequences used in this study

利用Excel 2016軟件分析中國明對蝦幼體和幼蝦不同組織FcBMP-7基因的表達量。利用SPSS 25.0中的單因素方差分析,對FcBMP-7基因在幼體不同時期間以及幼蝦不同規格間的轉錄表達差異進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 FcBMP-7基因的克隆及生物信息學分析

由于中國明對蝦轉錄組篩選得到的BMP-7基因cDNA序列不完整,因此分別進行5′RACE和3′RACE擴增5′和3′端的序列。其中5′RACE獲得541 bp序列 (圖1a),3′RACE得到409 bp序列 (圖1b)。與原序列拼接后得到中國明對蝦BMP-7基因2003 bp的全長cDNA序列,其中開放閱讀框為1242 bp,編碼413個氨基酸,5′非編碼區為466 bp,3′非編碼區為295 bp(圖2),將其命名為FcBMP-7基因(GenBank登錄號: MW048584)。

圖1 RACE擴增片段的電泳結果Fig.1 Eelectrophoresis of RACE amplificationa.5′ RACE電泳結果;b.3′ RACE電泳結果.a.electrphoresis of 5′ RACE amplification; b.electrphoresis of 3′ RACE amplification.

圖2 FcBMP-7基因的全長cDNA及推測編碼的氨基酸序列Fig.2 Full length cDNA and the putative amino acid sequence of FcBMP-7 gene黑色加粗部分為起始密碼子和終止密碼子;灰色陰影為磷酸化位點;實線方框為N-糖基化位點;下劃線為跨膜螺旋結構;斜體加粗的部分為TGF-β多功能肽.The initiator and the terminator are marked by black bold; the phosphorylation sites are denoted by gray shadow; the N-glycosylation sites are framed with solid lines; a transmembrane helix region is described as underlined part; the multifunctional peptide of TGF-β is expresse by italic bold.

該蛋白的等電點為6.20,分子質量為45.6 ku。蛋白功能結構域預測表明,在該基因編碼蛋白序列中,α螺旋占22.28%、延伸鏈占21.07%、β轉角占6.05%、無規則卷曲占50.60%(圖3)。

圖3 FcBMP-7蛋白的二級結構預測Fig.3 The prediction of the secondary structure for FcBMP-7 proteinConf.預測可信度;Cart.三態分配;Pred.三態預測;AA.目標序列.Conf.confidence of prediction; Cart.3-state assignment cartoon; Pred.3-state prediction; AA.target sequence.

2.2 FcBMP-7蛋白的同源性比對及系統進化樹分析

FcBMP-7蛋白的氨基酸序列與其他物種進行同源性比對分析結果見圖4。FcBMP-7蛋白與節肢動物各物種的BMP-7蛋白具有很高的相似性,在相對保守區域有7個半胱氨酸殘基,其位置分別是307、336、340、377、378、410、412位氨基酸。此外,該蛋白還含有1個跨膜螺旋結構域(13～35位氨基酸)和1個信號肽,信號肽的剪切位點位于第31和32位氨基酸之間。FcBMP-7蛋白與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)BMP-7蛋白的同源性最高,達到98%;其次是脊尾白蝦(Palaemoncarinicauda)和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),同源性分別是75%和72%;與軟體動物如文蛤(Meretrixmeretrix)及三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)等的相似性較低,同源性為30%～34%。

圖4 FcBMP-7蛋白序列與其他已知物種BMP-7蛋白的同源比對結果Fig.4 Results of homologous comparison between FCBMP-7 protein sequence and BMP-7 protein of other known speciesBMP-7氨基酸序列比對物種的GenBank登錄號:凡納濱對蝦BMP-7, XM_027355389.1;脊尾白蝦BMP-7, AYC12382.1;中華絨螯蟹BMP-7, AWV66904.1;擬穴青蟹BMP-7, AOZ56940.1;智人BMP-7, NM_001719.3;原雞BMP-7, XM_417496.6;莫桑比克羅非魚BMP-7, FN565169.2;非洲爪蟾BMP-7, NP_001079934.1.GenBank accessions numbers of BMP-7 amino acid sequence alignment:L. vannamei BMP-7, XM_027355389.1; P. carinicauda BMP-7, AYC12382.1; E. sinensis BMP-7, AWV66904.1; S. paramamosain BMP-7, AOZ56940.1; H. sapiens BMP-7, NM_001719.3; G. gallus BMP-7, XM_417496.6; O. mossambicus BMP-7, FN565169.2; X. laevis BMP-7, NP_001079934.1.

FcBMP-7蛋白的系統進化樹分析結果見圖5。中國明對蝦與凡納濱對蝦首先聚為一支,隨后與脊尾白蝦、中華絨螯蟹聚為一個甲殼類分支,然后與軟體動物如文蛤、三角帆蚌等分支共同形成一個大的無脊椎動物分支,整個無脊椎動物分支又與脊椎動物分支共同組成完整的進化樹,可見FcBMP-7蛋白在進化樹中與中國明對蝦的進化地位和分類階元基本一致。

圖5 基于鄰接法構建的FcBMP-7 蛋白與其他已知物種BMP-7蛋白的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of FcBMP-7 protein and other known species BMP-7 protein based on the neighbor-joining method

2.3 FcBMP-7基因的表達模式分析

2.3.1 FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體不同發育時期的轉錄水平分析

實時熒光定量PCR分析了FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體發育不同時期的表達情況,結果見圖6。FcBMP-7基因在中國明對蝦各幼體發育階段均有表達,但表達水平不同,其中在原腸期表達最低,從無節幼體階段開始表達量顯著增加,糠蝦幼體階段達到最高,仔蝦階段表達量顯著降低。

圖6 FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體發育不同時期的轉錄表達水平Fig.6 The relative expression level of FcBMP-7 gene in Chinese shrimp F. chinensis at different development stagesⅠ.原腸期;Ⅱ.無節幼體期;Ⅲ.溞狀幼體期;Ⅳ.糠蝦幼體期;Ⅴ.仔蝦期;不同字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05).Ⅰ.gastrula stage; Ⅱ.nauplius stage; Ⅲ.zoea stage; Ⅳ.mysis stage; Ⅴ.post-larval stage; means with different letters are significant differences among groups (P<0.05).

2.3.2 FcBMP-7基因在中國明對蝦2種規格幼蝦不同組織中的轉錄水平

FcBMP-7基因在中國明對蝦2種規格幼蝦不同組織中的表達結果見圖7。FcBMP-7基因的表達量在2種幼蝦大部分組織部位間存在顯著差異,除了肝胰腺和鰓組織外,在 (1.55±0.12) g幼蝦中FcBMP-7基因的表達量顯著高于(3.95±0.08) g幼蝦。在(3.95±0.08) g幼蝦不同組織中,表達量最高的是鰓,其次是胃、游泳足和步足,表達量最少的是肌肉;在(1.55±0.12) g幼蝦不同組織中,表達量最高的是鰓和游泳足,其次是步足和胃,表達量最少的是肝胰腺。

圖7 FcBMP-7基因在2種規格蝦不同組織中的表達水平Fig.7 The expression levels of FcBMP-7 gene in different tissues of large prawn and small juvenile shrimpA.肝胰腺;B.肌肉;C.腸道;D.心臟;E.胃;F.步足;G.游泳足;H.鰓; “*”表示兩組之間存在顯著性差異(P<0.05);“**”表示兩組之間存在顯著性差異(P< 0.01);“***”表示兩組之間存在顯著性差異(P<0.001).A.hepatopancreas; B.muscle; C.intestine; D.heart; E.stomach; F.periopod; G.pleopod; H.gill; “*” indicates significant difference between the two groups (P<0.05); “**” indicates significant difference between the two groups (P<0.01); “***” indicates significant difference between the two groups (P<0.001).

3 討 論

3.1 FcBMP-7基因的生物信息學分析

BMP-7蛋白作為TGF-β蛋白超家族中的一員,是Ozkaynak等[25]于牛成骨蛋白提取物中分離的一種新型轉化生長因子。筆者通過cDNA末端快速擴增技術擴增克隆得到了FcBMP-7基因全長cDNA,對FcBMP-7蛋白質結構域的分析發現,該蛋白的信號肽長度為31位氨基酸,在羧基末端有一個重要的TGF-β多功能結構域(第307～413位氨基酸),即成熟肽,該結構域可控制多種細胞的增殖、生長、分化等功能。信號肽與成熟肽之間的第32～307位氨基酸稱為前肽。與其他已知物種的BMP-7蛋白序列比對分析后發現,在此TGF-β保守結構域中,有7個高度保守的半胱氨酸殘基,與人BMP-7蛋白單體的半胱氨酸殘基結構相同, 可以形成3對鏈內二硫鍵, 剩余的1個半胱氨酸參與鏈間二硫鍵形成[26]。以上分析表明,FcBMP-7蛋白含有TGF-β蛋白超家族的特征序列,是TGF-β蛋白超家族中的多功能分泌性蛋白。對中國明對蝦BMP-7蛋白與其他物種BMP-7蛋白的氨基酸序列進行聚類分析并構建系統進化樹發現,即使經過漫長的進化和演變,對蝦類BMP-7蛋白和脊椎動物BMP-7蛋白仍具有較高的同源性,表明該基因在整個動物界可能保持著相似的生理功能。

3.2 FcBMP-7基因的表達情況分析

近年來,對BMP-7基因的研究多集中在臨床疾病[27-28]、軟骨形成[29-31]以及各組織纖維化[32-33]等,對其在肌肉生長和發育中作用的研究相對較少[34]。為探明BMP-7基因在蝦類肌肉生長發育中作用,筆者分析了FcBMP-7基因在中國明對蝦早期發育不同階段以及生長速率具有顯著差異的2種規格幼蝦不同組織中的表達水平。

3.2.1 FcBMP-7基因在中國明對蝦幼體不同發育時期的轉錄水平

本試驗中國明對蝦幼體不同發育時期的表達結果顯示,FcBMP-7基因在中國明對蝦早期發育的5個時期均有表達,特別是在無節幼體時期開始顯著高表達,在糠蝦幼體期顯著增加并達到表達高峰,仔蝦期表達量逐漸降低。中國明對蝦作為甲殼類的典型動物,具有其獨特的發育模式,主要是肌肉系統的生成和完善。中國明對蝦的肌肉從無節幼體時期開始陸續生成[35-36],糠蝦幼體期是肌肉生成的重要階段,直到仔蝦期形成了較為完善的肌肉系統[37]。肌肉生成的過程與FcBMP-7基因的表達變化規律一致,由此推測FcBMP-7基因可能在對蝦早期變態期的肌肉發生過程中發揮一定的作用,有待于后期進行深入的研究進行驗證。

3.2.2 FcBMP-7基因在中國明對蝦2種規格幼蝦不同組織中的轉錄水平

通過分析中國明對蝦2種規格幼蝦不同組織的表達結果發現,FcBMP-7基因在中國明對蝦的各組織中廣泛性表達,表明FcBMP-7基因并不具備組織特異性表達特征,可能在對蝦體內具有多種生理功能。值得注意的是,(3.95±0.08) g幼蝦FcBMP-7基因的表達量除了在肝胰腺中高于(1.55±0.12) g幼蝦外,在其他組織部位中的表達量均低于(1.55±0.12) g組幼蝦(鰓差異不顯著),與BMP-7基因在擬穴青蟹卵黃發育中的表達量隨著卵黃的成熟而呈逐漸降低的趨勢[38]相符合,并且存在明顯的組織差異性。Yan等[39]對比分析了與本試驗相同的2種規格幼蝦不同組織部位(肌肉、心臟、步足、游泳足、鰓)肌纖維的數量與直徑,結果顯示,在肌肉、游泳足和步足等組織部位中,兩組間肌纖維的數量與直徑差異顯著。雖然(3.95±0.08) g幼蝦的肌纖維數量明顯少于(1.55±0.12) g幼蝦,但是前者肌肉纖維的直徑明顯大于后者。綜合分析上述結果顯示:FcBMP-7基因可能參與調控肌纖維的數量與生長,作為調節因子參與了中國明對蝦幼蝦的肌肉生長過程。

4 結 論

本試驗結果初步表明,FcBMP-7基因在中國明對蝦肌肉的發生及生長過程中具有一定的表達水平,推測FcBMP-7基因可能作為調節因子參與了中國明對蝦幼蝦肌肉發生和幼蝦肌肉生長過程。該結果可為進一步研究FcBMP-7基因的功能提供重要的理論資料,同時為解析中國明對蝦肌肉生長發育的調控機制提供線索。