柑橘抗逆基因MYB96的克隆與表達分析

李 瀟,郭文芳,楊 莉,胡 威,匡柳青,劉德春,劉 勇

(江西農業大學 農學院,江西 南昌 330045)

柑橘的栽植面積及產值在我國果樹產業中占據著非常重要的地位,但其分布范圍和生長發育會受到低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫的制約[1]。植物體中的轉錄調控可以通過將轉錄因子與下游基因順式作用元件結合從而調控下游基因表達,在植物適應不同逆境脅迫的過程中發揮關鍵作用[2-3]。因此,對柑橘響應逆境脅迫相關轉錄因子的研究具有重要的理論和實踐意義。

MYB家族轉錄因子均含有保守的MYB結構域,根據其保守結構域N端所包含的R結構的數量,MYB轉錄因子可以分為4個亞家族:1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB[4-5]。近年來研究表明,R2R3-MYB轉錄因子具有調控脂質[6]、木質素[7]、花青素[8]以及黃酮醇[9]等多種代謝物合成的功能。同時,R2R3-MYB轉錄因子在植物響應高鹽[10]、干旱[11]、高溫[12]和低溫[13]脅迫過程中也發揮了重要的作用。

研究表明,擬南芥AtMYB96轉錄因子可以直接結合在編碼脂肪酸延伸酶(如KCS、KCR和ECR)的基因啟動子上,調控植物表皮蠟質的生物合成,從而增強轉基因植物抗旱性,并保護其免受病理性和機械性損傷[14-15]。目前,月季(Rosahybrida)[16]、蘋果(Maluspumila)[17]、山茶(Camelinasativa)[18]等植物的MYB96在基因表達和抗逆功能上的研究已有報道。

在柑橘中,關于MYB96轉錄因子的研究主要集中在調控甜橙外果皮蠟質生物合成以及減少采后甜橙果實失水的功能上[19]。為探索柑橘MYB96基因在響應逆境脅迫中的功能,本研究從不同的柑橘種類:甜橙、檸檬、金柑和蘆柑中克隆得到4個MYB96基因,對其生物信息學以及在不同種類的柑橘和不同逆境脅迫條件下的表達模式進行分析,為闡明MYB96基因在柑橘中響應非生物脅迫應答的作用奠定了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

參照盧婷等[20]的方法,培養甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck.)、檸檬(Citruslimon(L.)Burm.f.)、金柑(Fortunellamargarita(Lour.)Swingle.)、蘆柑(CitrusreticulataBlanco.)等4種柑橘材料的實生幼苗。幼苗培養28 d左右后,再用Hoagland液體營養液預培養3 d,之后進行非生物脅迫處理。將幼苗分別移置含有20% PEG6000和含有250 mmol/L NaCl的Hoagland液體營養液中進行干旱和高鹽處理。低溫處理則是將4種柑橘幼苗材料轉移到干凈的Hoagland營養液后,置于4 ℃培養箱中培養。每種處理用柑橘幼苗25株,以室溫(25 ℃)Hoagland 液體培養未做處理植株做對照(0 h),分別在3種處理1,3,6,12,24 h取其葉片,液氮速凍,-80 ℃儲存備用。試驗均進行3個生物學重復。

1.2 葉片總RNA提取及反轉錄

葉片總RNA提取、純度檢查和完整性評估按照郭文芳等[21]描述的方法進行。按照日本TOYOBO公司的反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA,存放于-20 ℃,備用。

1.3 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因克隆

在華中農業大學甜橙基因組數據庫查找獲得甜橙CsMYB96基因cDNA序列,使用Primer Premier 5.0設計引物CsMYB96-F和CsMYB96-R(表1),以甜橙、檸檬、金柑和蘆柑葉片第一鏈cDNA為模板,進行PCR擴增,得到CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因擴增產物,插入pMD18-T 載體并轉化到大腸桿菌中,菌液PCR鑒定為陽性后進行測序。引物設計和PCR擴增程序參照郭文芳等[21]的方法。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 生物信息學分析

在NCBI網站中的ORF Finder程序中獲取4個柑橘MYB96基因cDNA序列編碼區長度與氨基酸數量。在NCBI網站中的Blast程序進行氨基酸序列比對查找同源蛋白,利用SMART在線軟件進行蛋白序列保守結構域分析,并利用MEGA 7.0軟件中NJ法構建系統進化樹。蛋白理化性質利用ExPASy ProtParam在線分析工具分析預測;蛋白質二級及三級結構的預測分別利用SOPMA和SWISS MODEL完成;亞細胞定位用在線網站CELLO完成。甜橙CsMYB96基因上的啟動子分析利用Plant CARE在線網站完成。

1.5 實時熒光定量PCR

基于完成測序的CsMYB96基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件,設計CsMYB96基因實時定量引物qCsMYB96-F和qCsMYB96-R,內參基因為柑橘Actin基因(表1)。反應體系和程序參照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒說明書,每個樣品3次重復,利用2-ΔΔCT方法計算相對表達量。

2 結果與分析

2.1 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因克隆及序列分析

通過PCR擴增,分別從甜橙、檸檬、金柑和蘆柑的cDNA中克隆出MYB96序列,并分別命名為CsMYB96、ClMYB96、FmMYB9和CrMYB96。測序結果和序列分析結果表明,CsMYB96和CrMYB96的cDNA全長分別為1 215,1 214 bp,均含有1 032 bp的開放閱讀框,編碼343個氨基酸。ClMYB96和FmMYB96的cDNA全長均為1 218 bp,含有1 035 bp的開放閱讀框,都編碼344個氨基酸。

2.2 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白序列分析

對CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白的理化性質進行分析,結果表明,CsMYB96和CrMYB96蛋白分子量分別約為38.16,38.13 ku,理論等電點均為6.31;ClMYB96和FmMYB96蛋白分子量分別約為38.27,38.22 ku,理論等電點均為6.35。亞細胞定位預測結果顯示,4個MYB96蛋白核定位的預測分值均顯著高于非核定位預測分值,可以預測CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白定位于細胞核(表2)。一般認為總平均親水性系數小于0屬于親水性蛋白,預測結果顯示,這4個蛋白的不穩定指數分別為51.48,50.78,49.38,52.15,總平均親水性系數分別為-0.751,-0.766,-0.757,-0.762,所以推測它們都是不穩定親水性蛋白。再通過ProtScale在線軟件對其進行進一步的蛋白親疏水性預測,結果表明平均得分小于0,進一步證明它們均為親水性蛋白質(圖1-A)。

A.親疏水性分析;B.三級結構預測模型;C.磷酸化位點預測。A.Hydrophilicity and hydrophobicity analysis;B.Three dimensional structure prediction model;C.Phosphorylation site prediction.圖1 CsMYB96蛋白預測分析Fig.1 Prediction and analysis of CsMYB96

對CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白二級結構的預測結果如表2所示,這4個蛋白的二級結構相似,主要含有α螺旋和無規卷曲。因此,以CsMYB96蛋白為例,使用SWISS-MODEL在線工具獲得了CsMYB96蛋白三級結構模型,發現CsMYB96蛋白主要由螺旋和無規卷曲構成(圖1-B),與SOPMA中的二級結構分析結果一致。

表2 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白亞細胞定位預測及二級結構信息Tab.2 Subcellular localization prediction and secondary structure information of CsMYB96,ClMYB96, FmMYB96 and CrMYB96

對CsMYB96蛋白磷酸化位點預測結果表明,CsMYB96中絲氨酸磷酸化位點最多,約27個,蘇氨酸磷酸化位點約13個以及6個酪氨酸磷酸化位點(圖1-C)。因此,推測該基因主要通過絲氨酸磷酸化修飾調控其功能。

2.3 不同種類柑橘MYB96蛋白的同源性及系統進化分析

利用DNAMAN軟件將CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96蛋白與其他植物MYB蛋白氨基酸序列比對,結果顯示,這4條氨基酸序列有5個位點存在差異,序列一致性達99.56%,且與擬南芥AtMYB96、AtMYB94、山茶CsMYB96、蕪菁BrMYB96和鹽藻EuMYB96蛋白同源性較高,均具有高度保守的R2和R3結構域(圖2短線標出)。在R2和R3結構域中,均含有3個分別間隔19個堿基和間隔18個堿基的保守色氨酸(W)殘基,但在R3結構域中,第一個色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)所取代(圖2中用▲標出)。利用SMART在線軟件對這4個柑橘MYB96蛋白序列的分析結果顯示,它們的保守結構域分析結果一致很高,即氮端13—63位氨基酸和66—114位氨基酸的位置上含有2個SANT保守結構域;在碳端233—249位和258—274位氨基酸處含有2個低復合物區域,圖3中以甜橙CsMYB96蛋白的保守結構域分析結果為例。

圖2 多種植物MYB蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of MYB proteins in several plants

圖3 CsMYB96保守結構域分析Fig.3 CsMYB96 conserved domain analysis

同時利用MEGA 7.0對甜橙CsMYB96、檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96、蘆柑CrMYB96 蛋白與其他藻類、苔蘚、單子葉和雙子葉植物的MYB類似蛋白序列進行系統發育進化樹的構建。結果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96蛋白與同為蕓香科柑橘屬的克萊門氏小柑橘CcMYB96蛋白(XP 006440595.1)親緣關系最近;與擬南芥AtMYB96同屬于雙子葉植物分支,親緣關系較近;與其他不同種類的植物MYB類似蛋白的系統進化關系符合植物由藻類到苔蘚再到被子植物(單子葉植物、雙子葉植物)的進化歷程(圖4)。

圖4 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96與其他植物MYB蛋白的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of CsMYB96,ClMYB96,FmMYB96,CrMYB96 and MYB proteins in other plants

2.4 CsMYB96基因啟動子順式元件分析

利用PlantCARE對CsMYB96基因轉錄起始點上游2 000 bp的啟動子序列進行順式作用元件分析,結果表明,CsMYB96基因的啟動子除了含有TATA-box和CAAT-box這些基本的啟動子核心啟動元件外,還含有光響應元件如G-Box、AT1-motif、TCCC-motif等,以及多種非生物脅迫響應相關順式作用元件,主要有脫落酸響應元件(ABRE)、低溫響應元件(LTR)、厭氧響應元件(ARE)、參與干旱誘導的MYB結合位點(MBS)等(表3),這說明CsMYB96基因可能在柑橘抵御非生物脅迫時發揮作用。

2.5 CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96在非生物脅迫處理后的表達分析

對甜橙、檸檬、金柑和蘆柑分別進行4 ℃低溫、20% PEG6000和250 mmol/L NaCl處理,取其葉片進行實時熒光定量表達分析(圖5)。

A—C.甜橙葉片;D—F.檸檬葉片;G—I.金柑葉片;J—L.蘆柑葉片。不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。A—C.Sweet orange leaves;D—F.Lemon leaves;G—I.Kumquat leaves;J—L.Ponkan leaves.Different lowercase showed significant difference among treatments(P<0.05).圖5 柑橘MYB96在低溫、干旱、高鹽處理下的表達模式Fig.5 Expression pattern of citrus MYB96 under low temperature, drought and high salt treatment

4 ℃低溫脅迫下,葉片中甜橙CsMYB96和蘆柑CrMYB96基因表達趨勢一致,均為先下降后上升再下降,兩基因表達量最高值均為處理后6 h。其中甜橙CsMYB96基因表達量在4 ℃低溫處理后變化更顯著,約為對照的2.5倍;同時,蘆柑CrMYB96在葉片中表達量也上升至最高值,略大于對照;這2個基因的表達量在除處理6 h外的其他處理時段均低于對照。而檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96的表達量在低溫脅迫處理后均低于對照,說明這2個基因的表達受到了低溫脅迫的抑制。

20% PEG6000模擬干旱脅迫處理時,葉片中甜橙CsMYB96和檸檬ClMYB96基因表達在處理0～12 h趨勢一致,均為先下降后上升再下降,且兩基因表達量最高值均為處理后6 h。其中,甜橙CsMYB96在處理6 h的表達量約為對照的3倍;處理后24 h,其表達量恢復到處理前的水平。檸檬ClMYB96在處理6 h的表達量為對照的2倍左右;之后在處理12 h其表達量下降至與對照無顯著差異,但在處理24 h表達量再次出現小高峰,約為對照的1.5倍。而金柑FmMYB96和蘆柑CrMYB96基因表達量在模擬干旱脅迫處理后總體下降。

250 mmol/L NaCl 脅迫處理時,甜橙CsMYB96在葉片中的表達量在處理1～3 h顯著下降;處理6 h,甜橙CsMYB96被誘導上調表達,表達量達到最大值,之后表達量又逐漸降低。高鹽處理下,檸檬ClMYB96在葉片中的表達量被誘導表達,整體表達量均顯著高于對照。金柑FmMYB96的表達量在高鹽處理的短時間內被抑制,處理6 h,其表達量顯著上升,且高鹽處理24 h,其表達量達到最大值,約為對照的2.6倍。蘆柑CrMYB96基因表達量在高鹽處理下整體受到抑制。

3 結論與討論

在植物響應非生物脅迫的過程中,MYB轉錄因子處于調控中心位置,能夠調控大量下游抗逆基因表達,進而保護自身免受各種逆境脅迫的危害[22]。近年來,對MYB家族轉錄因子,尤其是R2R3-MYB亞家族轉錄因子在非生物脅迫調控中的作用機制有了較為深入的研究,越來越多的MYB家族轉錄因子被證實參與了植物非生物脅迫的調控。為探究MYB96基因在柑橘中是否也參與逆境調控過程以及在不同品種中是否存在差異,從甜橙、檸檬、蘆柑、金柑中分別克隆出CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96基因,并利用生物信息學方法對這4個柑橘MYB96基因序列進行了保守性和系統進化分析,以及蛋白結構預測和亞細胞定位預測。氨基酸序列分析結果顯示,這4個柑橘MYB96蛋白都具有R2R3類MYB轉錄因子特有的2個高度保守SANT結構域(R2和R3),這與趙先炎等[17]研究結果一致,表明克隆結果真實可靠。同時,蛋白質理化性質分析表明,這4個蛋白均為不穩定親水蛋白,易溶解。這與馬尾松[23]和菠蘿[24]中R2R3-MYB 轉錄因子的研究結果一致。此外,系統進化樹結果表明,4個柑橘品種間遺傳關系較近,位于同一分支。并與同屬植物CcMYB96親緣關系最近,與擬南芥AtMYB96同位于雙子葉植物這一大分支上,親緣關系較近。而與苔蘚和藻類植物MYB蛋白親緣關系較遠,這符合植物系統分類學的進化趨勢。

有研究表明,MYB轉錄因子可以同時參與多種脅迫信號響應,例如,過表達MdSIMYB1基因可以同時提高轉基因煙草和蘋果對干旱、低溫和鹽脅迫的耐受性[25]。在本試驗中,CsMYB96基因啟動子序列中包含多個植物逆境脅迫應答相關作用元件,如脫落酸響應元件、低溫響應元件、參與干旱誘導的MYB結合位點(MBS)。非生物脅迫處理表達分析結果也表明,經過4 ℃低溫、PEG模擬干旱脅迫處理6 h后,甜橙CsMYB96基因表達量上升。由此推測,CsMYB96基因可能同時受這2種非生物脅迫的誘導表達,參與植物非生物脅迫響應過程。

近年來,已報道的R2R3-MYB轉錄因子大多作為正調控因子參與非生物逆境響應,例如,擬南芥AtMYB96能夠響應干旱脅迫[14];番茄中R2R3-MYB轉錄因子LeAN2會受低溫氧化脅迫誘導表達,過表達該基因能夠促進花青素的積累,增強了其對低溫和氧化脅迫的抵抗力[26];水稻OsMYB55和OsMYB91能夠分別響應高溫和高鹽脅迫。與野生型相比,過表達OsMYB55和OsMYB91植株分別表現出較強的高溫和高鹽耐受性[27-28]。本研究中實時熒光定量PCR分析表明,檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96與蘆柑CrMYB96對于相同逆境脅迫做出的響應有所差異。檸檬ClMYB96和金柑FmMYB96基因在經250 mmol/L NaCl脅迫處理后,葉片中的表達量都有明顯提高。由此推測,檸檬ClMYB96和金柑FmMYB96可能作為正調控因子,參與高鹽脅迫的響應過程。但是,低溫、干旱和高鹽脅迫后,蘆柑CrMYB96基因的表達量在較短時間內受到了抑制。這與甘蔗R2R3-MYB基因Sc2RMyb1在受到NaCl脅迫后,表達量被抑制而明顯下調的結果相似[29]。植物應對非生物脅迫時,往往有許多基因參與調控,同一個基因發揮的作用也不相同。馮瑩瑩等[30]研究表明,在鹽脅迫處理下,白木香AsMYB2表達量顯著上升;而在低溫脅迫處理下,AsMYB2表達量顯著降低。因此,可能是檸檬ClMYB96、金柑FmMYB96與蘆柑CrMYB96在不同的脅迫處理下發揮的作用不同,導致其表達量受到誘導或抑制;而這3個MYB96基因對相同的脅迫處理做出的響應表現有所差異,則可能與檸檬、金柑和蘆柑這3個柑橘種類自身遺傳特性差異有關。

綜上所述,本研究克隆獲得了4個不同種類柑橘的MYB96基因,對其進行了生物信息學分析,并預測到CsMYB96啟動子含有多個脅迫相關元件。然后,進一步通過qRT-PCR試驗證明了這些基因受低溫、干旱和高鹽脅迫誘導或抑制表達。本研究為進一步鑒定柑橘中MYB96基因的抗逆功能奠定了基礎。