甜玉米雄性不育突變體ms2020的表型分析和基因定位

熊才運,王 陽,裴 虎,莫海偉,湯蘊琦,黃 君,2

(1.華南農業大學 農學院,廣東 廣州 510640;2.廣東省植物分子育種重點實驗室,廣東 廣州 510640)

植物雄性不育(Male sterility,ms),是指植物在有性生殖階段雄性生殖器官發育異常,不能產生正常的小孢子或雄配子的現象。目前,已經在玉米[1]、水稻[2]、油菜[3]、小麥[4]等多種主要農作物中觀察到雄性不育現象。雄性不育不僅是研究植物生長發育的重要內容,同時也是雜交育種的有效工具。玉米(ZeamaysL.)是一種雌雄同株的異花授粉作物,由于玉米植株相對容易分離,利用玉米雄性不育系進行雜交制種已經成為提高產量的重要途徑[5]。

玉米花藥的發育過程極其復雜,在發育過程中任何時期發生異常都可能會對花粉的育性產生影響。擬南芥[6]、水稻[7-8]等模式植物的花藥發育過程研究發現植物花藥發育的過程基本一致。Warmke等[9]將玉米花藥的形成過程大致分為以下8個時期:前胼胝質期、中心胼胝質期、減數分裂期、四分體時期、小孢子單核早期、小孢子單核晚期、二孢花粉時期、成熟花粉期。利用光學顯微鏡(Optical Microscope,OM)和電子顯微鏡(Electron Microscope,EM)觀察玉米核不育材料的花藥發育過程,發現育性相關基因主要影響花藥結構的分化、花粉母細胞的減數分裂、花粉壁形成和小孢子發育等階段,基因功能的異常最終導致敗育表型的產生[10]。目前,已發現的玉米核不育基因在玉米的10條染色體上均有分布,而且部分基因已經完成了克隆,例如ZmMs7[11]、ZmMs33[12]、ZmMs44[13]、ZmMs26[14]、ZmMs30[15]、ZmMS45[16],對其功能有也有了一些認知。

甜玉米作為重要的鮮食玉米,因其具有營養豐富、甜、鮮、脆、嫩等特點而深受消費者青睞[17]。甜玉米種質資源開發對甜玉米制種尤為重要,優質的甜玉米雄性不育系可提高制種效率,但目前關于甜玉米雄性不育系的研究較少。本研究對甜玉米不育突變體ms2020的田間不育特征及遺傳特性進行了分析,利用分子標記對該不育基因進行了精細定位,旨在為甜玉米雄性不育分子機理的研究鑒定理論基礎,將雄性不育基因與雜種優勢相結合直接服務于農業生產實踐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究以源自甜玉米自交系K78的雄性不育自發突變體malesterility2020(ms2020)及華南農業大學甜玉米課題組提供的甜玉米自交系材料M08為試驗材料。以ms2020作為母本,與M08雜交,構建F1及相應的F2遺傳群體,進行表型觀察、遺傳規律分析和基因定位。所有試驗材料種植于華南農業大學增城教學實驗基地,常規管理。

1.2 試驗方法

1.2.1ms2020突變體的表型鑒定和遺傳分析 觀察F2群體在營養生長階段的植株形態差異;植株抽雄后,取即將開花的小穗,在解剖鏡下觀察花藥的形態特征;用碘染法(1% I2-KI)鑒定花粉育性;取可育株和不育株的花藥,用戊二醛固定后,委托武漢邁斯普生物科技有限公司進行掃描電鏡,觀察花藥和花粉的外部形態。

于散粉期考察F2群體中各單株的育性表現,統計可育株和不育株株數,并計算其比例,通過卡方測驗進行分離比檢驗。

1.2.2 基因定位 散粉期分別選取F2的可育株和不育株各30株,用CTAB法提取基因組DNA,將濃度相近的DNA等體積混合后分別構建“野生型池”和“突變體池”,利用40K靶向測序基因型分型GBTS(Genotyping by target sequencing)技術,通過SNP-index關聯分析[18]和歐式距離(Euclidean Distance,ED)關聯分析[19]得到目的基因的初定位區間。在MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)網站下載玉米參考基因組(B73 RefGen_v4),使用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)軟件在Perl語言環境下查找初定位區間內的SSR位點,利用Primer3Plus(https://www.primer3plus.com/index.html)在線設計引物,并由北京擎科生物有限公司廣州分公司合成引物。擴大定位群體,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)在初定位區間內篩選交換單株,通過加密標記進一步縮小定位區間。

2 結果與分析

2.1 ms2020突變體的表型特征

在營養生長階段,ms2020植株與野生型植株無明顯差異;生殖生長階段,ms2020突變體植株雖能正常抽雄,但花藥不開裂、不散粉(圖1-A、B)。小穗解剖觀察,發現與野生型花藥相比,突變體花藥瘦小且顏色淡黃(圖1-B)。I2-KI(1%)染色,發現野生型花粉能夠正常染色(圖1-C),突變體花藥中包含不能正常著色的敗育花粉粒(圖1-D,黑色箭頭所指)。

A.野生型(左)和ms2020 (右)植株表型;B.散粉期野生型(左)和ms2020 (右)雄穗及小穗表型;C,D.野生型 (C)和ms2020 (D)花粉鏡檢,黑色箭頭所指為突變體花藥中的敗育花粉粒。A.Plant phenotypes of wild type(left)and ms2020 (right);B.Tassel and spikelet phenotypes of wild type(left)and ms2020 (right)at the pollination stage;C,D.Microscopic examination of pollen of wild type(C)and ms2020 (D),black arrows point to abortive pollen grains in mutant anthers.圖1 ms2020突變體和野生型表型Fig.1 Phenotypic of the ms2020 mutant and wild type

散粉期野生型和突變體花藥掃描電鏡結果顯示,突變體花藥外壁與野生型差異較大 (圖2-A、B)。野生型花藥外壁表皮細胞均勻且細長,被致密的角質層包裹,呈現立體網格狀結構,這是玉米花藥特有的表皮脊狀結構(圖2-C);而突變體花藥外壁細胞形狀不規則,且細胞表面無脊狀結構,但其表面有氣孔,如白色箭頭所指(圖2-D)。野生型花藥內部的花粉粒呈球形(圖2-E),突變體花藥內部不可見完整的花粉粒(圖2-F);野生型花粉外壁有細網-刺狀復合結構(圖2-G),突變體花粉粒已經解體(圖2-H)。

A,C.野生型花藥外壁;B,D.ms2020花藥外壁。突變體花藥表面有氣孔,如白色箭頭所示(D);E,G.野生型花粉外壁;F,H.ms2020花藥內部。A,C.Wild type anther outer wall;B,D.ms2020 anther outer wall.Mutant anther has stomata on the surface,as indicated by white arrows(D); E,G.Wild type pollen exine;F,H.ms2020 anther interior.圖2 ms2020和野生型花藥組織學觀察Fig.2 Histological observation of the ms2020 mutant and wild type

2.2 ms2020突變體遺傳分析

2.3 突變基因的定位

將測序數據進行過濾,質控后的數據與參考基因組(B73 RefGen_v4)對比,并進行區段SNP檢測。通過SNP-index關聯分析和歐式距離關聯分析(圖3),得到性狀候選區間位于第7號染色體1～7 922 318 bp。

A.F2 Δ(SNP-index)全基因組分布圖;B.ED關聯值在全基因組上的分布。A.Distribution profile of Δ(SNP-index)in F2 generation on whole genome;B.Distribution profile of ED values on whole genome.圖3 SNP-index關聯分析和歐式距離關聯分析Fig.3 SNP-index and Euclidean distance correlation analysis

在初定位區間內開發SSR標記,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選出在親本之間具有多態性的可用標記,共篩選出13對多態性標記,利用96株F2隱性不育單株進行驗證,發現在Y23和P6標記處的交換單株數目分別為9和11(圖4-A)。進一步在Z5標記(位于Y23之前)和P6標記之間開發標記,篩選出7對多態性標記,最終將突變基因定位在S1和W10之間 (圖4-B),物理距離約11.30 kb,包含Zm00001d018802和Zm00001d0188032個候選基因(圖4-C)。精細定位中篩選到的部分隱性單株分子標記檢測結果列于表1。

表1 部分隱性單株分子標記檢測結果Tab.1 Test results of markers in partial recessive individual plants

A.候選基因定位于7號染色體Y23和P6分子標記之間;B.候選基因精細定位在S1和W10之間的11.3 kb范圍內; C.精細定位區間內包含2個候選基因。紅色數字為交換單株數。A.Candidate gene was located between Y23 and P6 molecular markers on maize chromosome 7;B.Candidate gene was fine mapped to a 11.3 kb region delimited by S1 and W10 markers;C.Two candidate genes in the fine-mapped region.The red figures are the number of exchanged plants.圖4 ms2020突變體的精細定位Fig.4 Fine mapping of ms2020 mutant

利用MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)網站對候選基因進行注釋。Zm00001d018802注釋為一個雄性不育基因Ms22(malesterile22),編碼一個谷氧還蛋白(Glutaredoxin),導致花粉母細胞退化而造成雄性不育。Zm00001d018803功能未知。

3 結論與討論

BSA在作物改良方面具有廣闊前景,通過發展診斷和組成標記(Diagnostic and constitutive markers)、農藝基因組學(Agronomic genomics)、標記輔助選擇(Marker-assisted selection)和表型選擇(Selective phenotyping)來促進植物育種[20]。Zou等[20]結合BSA 和AFLP(Amplified fragment length polymorphism,擴增片段長度多態性),鑒定了玉米重組近交系中高粱霜霉病 (Sorghum downy mildew,SDM)抗性相關的4個AFLP標記,其中EM227、EM216、EM159為抗性標記,EM186為易感性標記。Agrama等[21]結合BSA和簡單重復序列(Simple sequence repeat,SSR),鑒定高耐寒品種和低耐寒品種之間的遺傳關系,其中bnlg1273、umc1124、dupssr21、mmc0251、mmc0181和phi041等SSR標記具有作為玉米耐寒性分子標記的巨大潛力。Klein等[22]結合BSA和單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP),將narrowodddwarf鑒定為teosintebranched1的增強子,并鑒定到一個defectivekernel1的新等位基因。本研究采用 BSA結合SSR標記的定位策略,成功定位到ms2020突變體的候選基因。

在ms2020甜玉米雄性不育突變體的定位區間里包含2個候選基因,Zm00001d018803功能未知,Zm00001d018802注釋為一個雄性不育基因ZmMs22,該基因也被注釋為ZmMSCA1(MALESTERILECONVERTEDANTHER1),編碼一個谷氧還蛋白(Glutaredoxin,GRX),參與了雄蕊原基的起始與花藥原基的分化過程。ms22/msca1突變體雖然可以正常進行雄蕊原基的起始,但之后不能進行正常的細胞分裂和分化,而是形成了一些表面含有氣孔的結構,包括實質細胞及異位的非功能性微管,這些結構通常不存在于正常玉米花藥中[23]。本研究中,掃描電鏡結果顯示,ms2020突變體花藥的表面存在與ms22/msca1突變體相似的氣孔結構,因此將Zm00001d018802作為ms2020甜玉米雄性不育突變體的重要候選基因。

谷氧還蛋白(GRXs)是一種生物體中普遍存在的谷胱甘肽依賴氧化還原酶,在NADPH和谷胱甘肽還原酶(GSH)存在下催化二硫鍵的還原,以調節靶蛋白的活性[24]。谷氧還蛋白系統由GRX、GSH和還原NADPH組成,它們在植物體內參與維持細胞內的氧化還原狀態,調節氧化還原反應所依賴的信號途徑。ZmMSCA1/Ms22除了控制著玉米花藥的發育,也被報道其轉位會引起莖尖分生組織的大小改變[25]。該基因調節莖分生組織大小的機制已有報道[25-26],但其引起雄性不育的機制未見報道。本研究中,ms2020突變體的花藥中包含不能正常著色的敗育花粉粒,但高永鋼[27]發現ms22突變體為無花粉型完全敗育突變體,推測2個突變體的表型差異可能突變位點的不同導致的。高永鋼[27]通過測序及序列比對,發現ms22突變體的不育表型并非由Ms22直接導致,而是該基因的TGA后900～1 300 bp處缺失62個堿基所導致。雖然缺失位點不在Ms22蛋白的翻譯區段,但約400 bp的片段丟失可能導致玉米7號染色體短臂附近的其他基因,或相鄰染色體同一染色體片段出現交換異常。本研究雖已明確ms2020突變體的突變基因為Zm00001d018802,但其突變位點和作用機制需進一步深入。

玉米雄性不育突變體在發育后期,小孢子或花粉都會塌陷,本研究的掃描電鏡結果顯示,ms2020突變體符合這一基本特征。但不同的雄性不育突變體其敗育特征不盡相同,花粉壁和絨氈層結構的異常極可能導致雄性不育?；ǚ郾诎ǚ蹆缺诤屯獗?外壁的主要組成成分為脂肪族物質及其衍生物[28],已報道的ZmMs26和ZmMs30基因都與脂質合成代謝有關,但敗育過程略有差異。ZmMs26突變導致脂肪酸代謝途徑異常,花藥發育所必需的脂肪類物質供應不足,不能形成正常的花粉壁和花藥角質,最終植株敗育[14];ZmMs30編碼一種具有不同催化殘基的新型GDSL脂肪酶,在第7～9階段玉米花藥中特異性表達,其功能的喪失導致花藥表皮缺陷、不規則的花粉外壁足層以致完全雄性不育[15]。研究表明,絨氈層細胞是植物花粉外壁發育過程的重要參與者,絨氈層細胞的程序化死亡為小孢子發育提供物質基礎,其降解后產生的營養物質和胼胝質是合成花粉壁所需的[29],特別是由絨氈層合成并分泌的孢粉素(Sporopollenin)物質,是形成花粉壁的最主要物質[30]。此外,絨氈層和胼胝質的適時降解是小孢子正常發育的重要保障[31-32]。ZmAPV1在脂肪酸羥基化途徑中起作用,該途徑參與形成孢粉素前體和角質單體,這對玉米中花粉外壁和花藥表皮的發育至關重要[33]。ZmMs7過早表達會造成絨氈層發育異常及花粉壁異常,最終導致小孢子解體[11]。ms2020突變體的敗育機制和不育基因的調控機制有待深入研究。

本研究對甜玉米不育突變體ms2020進行了田間不育性狀表型鑒定、遺傳分析和基因精細定位,研究結果顯示,ms2020的不育性狀是的不育性狀受單隱性核基因控制,突變體花粉表現為敗育。通過構建分離群體,區間內開發SSR標記,最終將候選基因定位在S1和W10之間,物理距離約11.30 kb,包含Zm00001d018802和Zm00001d0188032個候選基因;通過候選基因分析,推測已報道為玉米雄性不育基因的Zm00001d018802(ZmMs22/ZmMSCA1)是導致ms2020甜玉米雄性不育突變體表型的功能基因,但其突變位點及發揮功能的作用機制有待進一步深入。本研究為進一步解析ms2020基因調控甜玉米雄性不育的分子機制奠定了基礎,也為創造優良甜玉米雄性不育系提供了新的研究材料。