基于網絡藥理學和分子對接研究喘可治注射液治療支氣管哮喘的機制

周域，鄧麗平，胡俊，吳勐，壽玥鶯，高潔婷，李韋

平湖市第一人民醫院藥劑科，浙江平湖 314200

支氣管哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應性為特征的異質性疾病[1]，以發病率高、危害大、反復發作為特點，對人體生命健康造成嚴重危害。目前，全球支氣管哮喘患者已超過3.58 億，其中我國約占6.67%[2]。臨床常采用β2受體激動劑、M 膽堿受體阻斷劑、吸入性糖皮質激素、白三烯受體阻斷劑、磷酸二酯酶抑制劑等藥物治療，但不良反應較多、易耐受等問題突出。中醫治療支氣管哮喘能夠改善患者癥狀且不良反應少，不易產生耐藥性，具有一定的治療優勢。中醫認為腎主納氣，若腎氣不足，則出現呼多吸少、吸氣困難、動則喘甚等癥。喘可治注射液為國家二類新藥，主要由淫羊藿、巴戟天組成，其味甘性溫，入脾腎經，功能溫腎助陽，止咳平喘[3]。本文采用網絡藥理學與分子對接驗證對喘可治注射液治療支氣管哮喘的活性成分、靶點、通路、生物過程等進行研究，為臨床合理用藥提供佐證。

1 資料與方法

1.1 確定活性成分

運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中藥綜合數據庫（traditional Chinese medicine integrated database，TCMID）中以“淫羊藿”“巴戟天”為關鍵詞檢索喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天2 味中藥的活性成分，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18 為標準進行篩選，并結合相關文獻納入活性成分。從ChemicalBook、PubChem 中獲得活性成分相關化學信息及化學結構，保存為sdf 格式文件。

1.2 活性成分-靶點篩選

將從PubChem 數據庫中獲取的活性成分的分子結構上傳至SwissTargetPrediction 數據庫。以“淫羊藿”“巴戟天”為關鍵詞在TCMSP 數據庫中檢索喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天2 味中藥的活性成分所對應靶蛋白，在人類基因數據庫（the human gene database，GeneCards）中將所得靶蛋白轉換為對應靶點，整合并刪除以上2 個數據庫中重復靶點后明確活性成分中的最終靶點。

1.3 疾病靶點篩選及活性成分-支氣管哮喘靶點構建

以“支氣管哮喘（bronchial asthma）”為關鍵詞，在GeneCards、比較毒理基因組學數據庫（comparative toxicogenomics database，CTD）中進行檢索。整合去重后得到支氣管哮喘靶點。將支氣管哮喘靶點與活性成分靶點輸入Fun Rich 軟件，二者交集作為喘可治注射液治療支氣管哮喘的靶點，將上述靶點導入Cytoscape軟件構建活性成分-支氣管哮喘靶點圖。

1.4 活性成分-靶點相互作用網絡構建

將活性成分-靶點導入STRING 平臺構建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值“medium confidence=0.4”，其他參數保持默認值。將PPI 網絡導入Cytoscape 軟件，利用“network analysis”功能計算各網絡節點的度值、介數及最短路徑等拓撲參數，節點的度值、介數、最短路徑越大，該節點在網絡中的位置就越重要[4]。選取度值、介數、最短路徑同時在平均值之上的靶蛋白、活性成分作為喘可治注射液治療支氣管哮喘的關鍵靶點和關鍵活性成分。

1.5 KEGG 通路富集和GO 生物過程分析

運用DAVID 數據庫以P＜0.05 為標準，對喘可治注射液治療支氣管哮喘的靶點進行KEGG 信號通路富集，在OmicShare 云平臺進行可視化處理。利用Origin 軟件將得到的GO 生物過程進行可視化處理并以圖片形式輸出。

1.6 活性成分與支氣管哮喘關鍵靶點的分子對接驗證

從PDB 蛋白質結構數據庫下載關鍵靶點的蛋白質結構。借助PyMOL 將靶蛋白與原配體分離，同時去除靶蛋白的水分子、磷酸根及多余的非活性配體，進行分子對接前的處理。將靶蛋白導入AutoDuck Tools進行加氫、電荷等操作。將關鍵活性成分的2D 結構導入Chembio3D 后，以mol2 的格式保存，將靶蛋白、原配體、關鍵活性成分3D 結構統一設置成AutoDuck Tools 可識別的pdbqt 格式。設置原配體所在部位為活性口袋位點，進行關鍵靶蛋白和關鍵活性成分的分子對接，以評價活性成分與靶點的結合強度。

2 結果

2.1 活性成分篩選

通過檢索TCMSP、TCMID 數據庫，結合文獻篩得喘可治注射液中淫羊藿、巴戟天的活性成分，其中7 個活性成分來自淫羊藿，2 個活性成分來自巴戟天，見表1。

表1 喘可治注射液的主要活性成分信息

2.2 喘可治注射液靶點預測及其靶點-活性成分網絡圖構建

檢索TCMSP、SwissTargetPrediction、GeneCards數據庫中巴戟天、淫羊藿的活性成分相關靶點，整合去重后得到活性成分靶點 112 個。檢索整合GeneCards、CTD 數據庫中支氣管哮喘相關靶點，得到2369 個疾病靶點。將活性成分靶點和支氣管哮喘靶點導入Fun Rich 軟件，去重后得到66 個治療支氣管哮喘靶點，見圖1。將活性成分及其靶點導入Cytoscape 軟件，得到靶點-活性成分網絡圖，見圖2。

圖1 活性成分-疾病靶點韋恩圖

圖2 活性成分-疾病網絡圖

2.3 靶點PPI 網絡分析

將66 個活性成分-疾病靶點導入STRING 平臺，在Cytoscape 軟件中進行可視化處理，PPI 網絡中共有66 個節點，420 條相互作用連線，平均度值為12，平均介數為0.016，見圖3。度值和介數均大于平均值的靶點有18 個，見表2；度值、介數均大于平均值的活性成分有5 個，見表3。由此預測喘可治注射液中關鍵活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定B、淫羊藿A、低聚七糖、蔗果四糖，主要通過調節腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、β2 腎上腺素受體（beta2 adrenergic receptor，ADRB2)、5-羥色胺轉運體基因（SLC6A4）等18 個關鍵靶點達到治療支氣管哮喘的功效。

表2 關鍵靶點及其拓撲參數

表3 活性成分拓撲參數

圖3 靶點PPI 網絡

2.4 KEGG 信號通路分析

將喘可治注射液66 個支氣管哮喘靶點富集在KEGG 信號通路上，根據P＜0.05 篩選得到支氣管哮喘相關信號通路13 條，見表4。富集因子較大的通路包括絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、環鳥苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）/cGMP 依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路等。

表4 KEGG 信號通路

2.5 GO 功能富集分析

以P＜0.05 為原則在DAVID 數據庫對66 個支氣管哮喘靶點進行GO 功能富集分析，得到12 條生物過程，見表5。預測喘可治注射液可能通過參與這些生物過程治療支氣管哮喘。

表5 GO 功能富集分析

2.6 分子對接

分別選取淫羊藿、巴戟天中度值、介數排名第一的有效成分淫羊藿次苷I 和蔗果四糖，與排名前5位的支氣管哮喘相關靶點進行分子對接驗證。結果顯示淫羊藿次苷I 與TNF、前列腺素內過氧化物酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）結合程度高，蔗果四糖與信號轉導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、α2A 腎上腺素能受體（alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）結合程度高，見圖4。

圖4 關鍵活性成分與作用靶點分子對接結果

3 討論

支氣管哮喘屬中醫哮證、喘證、痰飲等范疇，中醫認為支氣管哮喘的發生與宿痰內伏于肺有關[5]。支氣管哮喘對身體健康和日常生活具有一定危害，急性發作時需采取積極治療措施以控制臨床癥狀。中成藥喘可治注射液的主要成分為淫羊藿、巴戟天，能夠有效發揮止咳平喘、補益腎肺、化痰健脾、固本培元之功效[6]。淫羊藿始載于《神農本草經》，為小檗科植物淫羊藿的干燥地上部分[5,7]。實驗證明淫羊藿可使哮喘大鼠下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素mRNA 表達明顯上調[8]。巴戟天是我國著名的四大南藥之一，具有抗應激、抗炎的功效[9]。

本研究結果顯示，淫羊藿中活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿A、朝藿定B 和巴戟天中活性成分蔗果四糖、低聚七糖均為治療支氣管哮喘的關鍵活性成分。其中淫羊藿苷可明顯減輕氣道炎癥反應、改善哮喘癥狀[7,10]。現代藥理研究證實朝藿定B具有祛痰平喘的作用[11]；淫羊藿次苷I、淫羊藿A、蔗果四糖、低聚七糖度值大、類藥性高，能與多個支氣管哮喘靶點相互作用，提示這4 種活性成分可能是喘可治注射液治療支氣管哮喘的關鍵活性成分。由PPI 和分子對接驗證得到TNF、PTGS2、VEGFA、STAT3、ADRA2A 為喘可治注射液治療支氣管哮喘的關鍵靶點。TNF-α 是哮喘氣道中的前炎癥細胞因子，也是哮喘炎癥過程中的重要啟動因子[12]。TNF-α可通過調控細胞因子、黏附分子和黏液素的表達和釋放，增強局部血管通透性，促進支氣管炎癥介質釋放和炎癥介質之間相互作用，其水平越高，表明病情越嚴重[13-14]。PTGS 又稱環加氧酶，誘導型PTGS2 參與花生四烯酸代謝，能誘發哮喘急性發作[15]。馬素麗等[16]研究稱STAT3 參與兒童支氣管哮喘的發生和進展，對哮喘的氣道炎癥具有一定的調節作用。Guan 等[17]發現VEGFA 不論在輕中度哮喘組與正常組還是重度哮喘組與正常組均是蛋白質相互作用網絡中的樞紐蛋白，提示VEGFA 可能與哮喘的發病有重要關系。

本研究通過分析得到13 條與支氣管哮喘有關的KEGG 通路和12 條GO 生物過程。其中PI3K/Akt信號通路廣泛存在于細胞中，Durham 等[18]認為PI3K可能通過刺激Akt 活化而進一步促進關鍵基因TNF表達，從而參與到哮喘的炎癥反應中。實驗發現，哮喘發生時缺氧誘導因子1、VEGF 表達水平均明顯升高，從而使嗜酸性粒細胞、巨噬細胞等炎癥細胞及細胞因子聚集參與氣道炎癥、氣道重塑等過程，促進哮喘的發生發展[19]。MAPK 信號通路是參與支氣管哮喘發病及進展的一條重要通路，通過調控免疫/炎癥細胞和氣道結構細胞，引起氣道高反應和氣道重塑，最終誘發支氣管哮喘[20]。本研究發現ErbB、T 細胞受體等信號通路也可能與支氣管哮喘發生機制有關，但尚需進一步論證。以上通路可能參與炎癥反應的調節、一氧化氮生物合成過程的正調控、細胞外信號調控激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）1 和ERK2 級聯的正調控、T 細胞凋亡的調節等多個生物過程從而協同發揮作用。ERK包括兩種異構體ERK1 和ERK2，楊季國等[21]發現ERK1/2 在支氣管哮喘氣道重塑中起重要作用。一氧化氮是由體內半必需氨基酸左旋-精氨酸在一氧化氮合成酶作用下合成的，一氧化氮在哮喘發病中具有雙刃劍作用：小劑量的一氧化氮可舒張支氣管平滑肌，而高水平的一氧化氮則表現為炎癥及細胞毒性[22]。核因子κB 通過參與氣道重塑及炎癥反應，在支氣管哮喘發病過程中起一定作用[23]。結合文獻報道與網絡藥理學方法說明喘可治注射液能從抗炎、抗凋亡、調節增殖等方面治療支氣管哮喘。

綜上所述，喘可治注射液中的關鍵活性成分淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿A、朝藿定B、蔗果四糖、低聚七糖可作用于TNF、PTGS2、VEGFA、STAT3、ADRA2A 等關鍵靶點，調節MAPK 等通路和參與炎癥反應調節等生物過程，起到治療支氣管哮喘的作用，為后續實驗論證提供了思路、奠定了基礎。