沉默SNAI1 對口腔鱗狀細胞癌細胞生物活性的影響

武艷飛，楊衛平，邵莉

湖州市第一人民醫院口腔科，浙江湖州 313000

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）約占口腔惡性腫瘤的90%。在過去的20 年中，OSCC 的治療手段有所進展，但OSCC 患者的5年生存率仍不足55%[1]。轉錄因子SNAI1 為轉錄抑制因子Snail 家族成員之一，目前普遍認為，SNAI1可通過調控下游靶基因上皮鈣黏素（E-cadherin）等的表達介導腫瘤細胞發生上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT），促進腫瘤的遷移與侵襲。相關文獻證實，SNAI1 在黑色素瘤、結腸癌、胃癌、肝癌、口腔鱗癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤中高表達[2-8]。但SNAI1 在OSCC 中的研究較少，本研究通過沉默轉錄因子SNAI1 觀察其在OSCC Tca8113 細胞中的表達情況及對OSCC Tca8113 細胞生物活性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

人舌鱗癌細胞Tca8113（貨號：BFN60700396）購買于BFB 生命科學有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養基（貨號：10567014）、胎牛血清（fetal boyine serum，FBS）（貨號：SH30080.03）、0.25%胰酶消化液（貨號：SH30042.01）均購自美國Gibco 公司；脂質體LipofectamineTM2000（Invitrogen，美國，貨號：11668027）；MTT 檢測試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒（上海嶸崴達實業有限公司，貨號：23250、4890-025-K）；SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（Perfect Real Time）（TAKARA公司，日本，貨號：RR820A、RR047AA）；膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒（BD 公司，美國，貨號：556547）；GAPDH 兔多抗（Bioworld 公司，美國）；兔抗SNAI1、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3)、兔抗基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9（Abcam，美國，貨號：ab216347、ab13748、ab92536、ab228402）；兔抗Bax、兔抗c-Myc、兔抗Bcl-2、兔抗cyclin D1（R&DSYSTEMS，美國，貨號：MAB846、MAB3696、MAB8272、MAB4314）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（Santa Cruz 公司，美國，貨號：sc2004）；SNAI1 shRNA（sh-SNAI1）及其陰性對照（sh-control）（上海生工生物公司）。

流式細胞儀（BD 公司，美國）；酶聯免疫標記分析儀（雷勃Multiskan MK-3，芬蘭）；CO2培養箱（SHEL-LAB 公司，美國）；熒光定量聚合酶鏈反應儀（ABI 公司，美國）；倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 Tca8113 細胞復蘇后，將其置于10% FBS DMEM 培養基中，在37℃、含5%CO2的培養箱中培養。

1.3.2 細胞轉染與實驗分組 實驗分為 3 組：Tca8113 細胞組、sh-control 組、sh-SNAI1 組，其中sh-control 組、sh-SNAI1 組分別用 sh-control、sh-SNAI1 轉染Tca8113 細胞，而Tca8113 細胞組不作任何處理，轉染48h 后進行檢測。

1.3.3 MTT 法檢測Tca8113 細胞增殖 Tca8113 細胞調整為1×105個/ml，將其接種于96 孔板（100μl/孔），48h 后，添加MTT 溶液10μl，4h 后，每孔添加二甲基亞砜150μl，充分混勻，酶標儀檢測492nm波長處的光密度（optical density，OD）值。細胞存活率=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.3.4 流式細胞術檢測Tca8113 細胞凋亡 各組Tca8113 細胞培養24h 后，依據Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書的操作方法，先加入5μl Annexin V-FITC，再加入5μl PI，室溫條件下避光反應20min，使用流式細胞儀觀察各組Tca8113 細胞凋亡情況。

1.3.5 Transwell 實驗檢測Tca8113 細胞侵襲能力首先在小室內加入100μl 稀釋好的Matrigel 基質膠放置超凈臺紫外線消毒殺菌過夜，在小室上部加入200μl 無血清培養基，下室中加入600μl 含10% FBS的DMEM 高糖培養液，48h 后棄去24 孔板下室中的培養基，加入無水乙醇對細胞進行固定，結晶紫染色，輕輕擦掉未侵入基質膠中的Tca8113 細胞，顯微鏡下觀察并記錄侵襲細胞個數，取平均值。

1.3.6 劃痕愈合實驗評估Tca8113 細胞遷移能力Tca8113 細胞以l×106cell/ml 的濃度接種于6 孔板，使用10μl 槍頭進行劃線，分別在0h 和24h 觀察拍照記錄同一位置的劃痕寬度，并依據公式[劃痕愈合率=（0h 劃痕寬度-24h 劃痕寬度）／0h 劃痕寬度×100%]計算劃痕愈合率。

1.3.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測 SNAI1 mRNA 表達水平 利用Trizol 一步法進行RNA 提??；取1μl RNA 利用反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA。采用SYBR Green 試劑盒評價SNAI1 mRNA表達水平。循環條件如下：94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 20s 和72℃ 40s，35 個循環，最后72℃ 5min。引物序列：SNAI1 正向引物5'-TTCTTCTGCGCTA CTGCTGCG-3'，反向引物5'-GGGCAGGTATGGAG AGGAAGA-3'；GAPDH 正向引物5'-GCACCGTCAA GGCTGAGAAC-3'，反向引物5'-TGGTGAAGACGC CAGTGGA-3'。

1.3.8 蛋白質印跡法檢測SNAI1、c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平 按照實驗分組處理細胞后48h，收取各組細胞，分別加入蛋白裂解液進行總蛋白提取。用BCA蛋白試劑盒檢測其蛋白濃度，于99℃進行蛋白變性，并進行10% SDS 凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封膜1h，分別添加兔抗SNAI1（1∶500）、c-Myc（1∶1000）、cyclin D1（1∶200）、Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶1000）、caspase-3（1∶500）、MMP-2（1∶200）、MMP-9（1∶200）4℃下過夜孵育，次日添加兔二抗（1∶5000）孵育膜1h，再使用ECL 底物進行顯色，Image J 軟件進行定量分析。實驗重復3 次。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據統計分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，符合正態分布及方差齊性的采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Tca8113 細胞中SNAI1 mRNA 表達水平

sh-control組和Tca8113細胞組中SNAI1 mRNA表達水平比較差異無統計學意義[（1.07±0.14）vs.（1.06±0.13），P＞0.05]；但與sh-control 組相比，sh-SNAI1 組中SNAI1 mRNA 表達水平顯著降低[（1.07±0.14）vs.（0.51±0.08），P＜0.05]。

2.2 沉默SNAI1 對細胞存活率的影響

sh-control 組與Tca8113 細胞組的細胞存活率和c-Myc、cyclin D1 蛋白表達比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；但與sh-control 組相比，sh-SNAI1 組的細胞存活率和c-Myc、cyclin D1 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 各組增殖相關蛋白條帶圖

表1 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞增殖的影響（）

表1 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞增殖的影響（）

注：與sh-control 組比較，*P＜0.05

2.3 沉默SNAI1 對細胞凋亡的影響

sh-control 組和Tca8113 細胞組的細胞凋亡率和Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；sh-SNAI1 組的細胞凋亡率和Bax、caspase-3 蛋白表達顯著高于sh-control組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表達顯著低于sh-control組，見圖2、表2。

表2 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞凋亡的影響（）

表2 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞凋亡的影響（）

注：與sh-control 組比較，*P＜0.05

圖2 各組凋亡相關蛋白條帶圖

2.4 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞遷移能力的影響

sh-control 組和Tca8113 細胞組的劃痕愈合率比較差異無統計學意義[（26.38±2.53）%vs.（25.66±2.37）%，P＞0.05]；與sh-control 組比較，sh-SNAI1 組的劃痕愈合率顯著降低[（26.38±2.53）%vs.（10.36±1.53）%，P＜0.05]，見圖3。

圖3 劃痕試驗檢測各組細胞的遷移能力（×100）

2.5 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞侵襲能力的影響

sh-control 組和Tca8113 細胞組的侵襲細胞數比較差異無統計學意義[（165.77±12.16）個vs.（164.89±12.55）個，P＞0.05]；與 sh-control組比較，sh-SNAI1 組的侵襲細胞數顯著減少[（165.77±12.16）個vs.（80.13±11.37）個，P＜0.05]，見圖4。

圖4 Transwell 實驗檢測各組細胞侵襲能力（結晶紫染色，×200）

2.6 沉默SNAI1 對Tca8113 細胞SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達的影響

sh-control 組和Tca8113 細胞組的SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；與sh-control 組比較，sh-SNAI1 組的SNAI1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），見圖5、表3。

圖5 各組SNAI1 蛋白及侵襲遷移相關蛋白條帶圖

表3 沉默SNAI1 對SNAI1、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響（）

表3 沉默SNAI1 對SNAI1、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響（）

注：與sh-control 組比較，*P＜0.05

3 討論

OSCC 是常見的惡性腫瘤，盡管治療手段取得較大進展，但OSCC 患者的存活率仍低于50%[9-10]。OSCC 發病機制復雜，至今尚未完全明確。

SNAI1 作為關鍵的EMT 調節因子，在侵襲和轉移中發揮重要作用，主要與SNAI1 抑制E-cadherin表達而介導上皮細胞向間充質細胞轉化有關[11]。在骨肉瘤細胞研究中，miR-153 通過靶向抑制SNAI1控制腫瘤細胞的浸潤、遷移和EMT[12]。在乳腺癌MCF7 細胞中，沉默SNAI1 可影響EMT 相關蛋白表達，減弱腫瘤的擴散、遷移和侵襲能力[13]。此外，值得注意的是，在OSCC 細胞系SCC-9 和HSC-4 的細胞研究中，核粒梭菌可通過上調SNAI1 表達，促進OSCC 細胞中EMT 轉化[14]。另外，Yang 等[15]研究發現SNAI1 在OSCC 組織中高表達，且與T 分期、淋巴結轉移、臨床分期和分化程度有關，與Song 等[16]研究結果相吻合，對OSCC 的臨床診斷、預后預測和靶向治療具有重要的理論參考價值?；谝陨涎芯浚敿毎D染sh-SNAI1 后，SNAI1 mRNA 表達水平顯著降低，細胞存活率、劃痕愈合率與侵襲細胞數顯著降低，凋亡率顯著升高，Tca8113 細胞增殖、遷移、侵襲均降低，促進細胞凋亡；蛋白質印跡法檢測結果顯示，cyclin D1、MMP-2、MMP-9、c-Myc、Bcl-2 水平顯著降低，細胞凋亡蛋白caspase-3、Bax水平顯著升高，進一步表明沉默 SNAI1 可抑制Tca8113 細胞的惡性行為。

綜上所述，沉默SNAI1 可抑制OSCC 的增殖、侵襲與遷移，促進細胞凋亡，為OSCC 的診治提供新靶點，但由于機制復雜，單一細胞研究存在不足之處，后續將進一步研究以證實。