生物技術藥物氧化檢測方法研究進展

李思，羅順*

（1.江西中醫藥大學，江西南昌 330004；2.南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇南通 226133；3.澳斯康生物（南通）股份有限公司，江蘇南通 226133）

單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAb）因整體穩定性和可制造性，是用于治療多種疾病（包括癌癥、關節炎、免疫性疾病）的最成功的生物技術藥物[1-3]。盡管單克隆抗體是一類非常穩定的治療蛋白，在患者中表現出非常好的藥代動力學特征，但它們在生產和儲存過程中仍然容易受到各種翻譯后修飾的影響。常見的翻譯后修飾包括糖基化、N末端谷氨酰胺環化、C 末端賴氨酸丟失、脫酰胺、異構化和氧化[4-5]。

在這些修飾中，通常檢測到氧化，并且是由活性氧與暴露于溶劑的氨基酸殘基，如甲硫氨酸（methionine，Met）和色氨酸（tryptophan，Trp）反應引起的[4]。氧化過程中涉及的機制很復雜且視具體情況而定：甲硫氨酸容易被過氧化氫通過親核取代反應氧化生成甲硫氨酸亞砜和甲硫氨酸砜；色氨酸氧化在機理上不同于甲硫氨酸氧化，只容易被自由基和激發態氧物質氧化，通過多種途徑降解生成各種氧化產物，包括5-羥基色氨酸、羥基吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸[6]。氧化可以誘導結構變化，可能會影響單克隆抗體的生物學功效、安全性和免疫原性。尤其是甲硫氨酸和色氨酸側鏈氧化，已顯示會影響抗體結合片段結晶域（fragment crystallizable，Fc）受體[7-8]和抗原[9]，并影響單克隆抗體穩定性和半衰期[10]。因此，在藥物研發和生產的不同階段監測和表征氧化是至關重要的。

在藥物可開發性評估中，計算機模擬日益成為一種常見的預測生物技術藥物氧化的方法，其優點是樣品消耗少、速度快、成本低。近十年來，計算機模擬已用于預測生物技術藥物翻譯后修飾易感位點和設計具有更好化學穩定性的抗體。本文就生物技術藥物氧化的檢測方法、計算機模擬預測氧化進行重點介紹。

1 氧化及其對生物技術藥物的影響

1.1 影響氧化的因素

氧化速率取決于肽或蛋白質主鏈的整體結構和活性的內在因素以及外在因素，例如pH、溫度、緩沖液組成、賦形劑（如組氨酸、聚山梨酸）、金屬離子、光、過氧化物及溶解氧[11]。單克隆抗體生產過程也會影響氧化，這是由過氧化物、大氣氧和氧化還原活性金屬離子的存在引起的。

1.2 氧化對生物技術藥物的影響

氧化氨基酸在蛋白質序列中的位置對于它們對蛋白質結構、功能和生物學反應的影響至關重要，尤其是對于單克隆抗體而言，結合特性對與目標抗原的順利結合至關重要。藥代動力學特征的變化高度依賴于發生氧化的位置，來自Fc 區的甲硫氨酸的氧化可以減少與新生兒Fc 受體的結合以及相關單克隆抗體的生物半衰期[8,10]。在人類新生兒Fc 受體（neonatal Fc Receptor，FcRn）轉基因小鼠中觀察到的藥代動力學損傷的主要原因是M252 氧化。在這項研究中，當兩個免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）重鏈（Heavy Chains，HC）的M252 被氧化時，觀察到血漿清除率增加，互補決定區（Complementarity-Determining Regions，CDR）中的甲硫氨酸或色氨酸的氧化可能會導致效力和抗原結合能力的喪失[12]。

2 生物技術藥物氧化的檢測方法

2.1 反相-高效液相色譜法

YANG 等[13]開發了一種可靠、準確的反相-高效液相方法來檢測單克隆抗體重鏈上的色氨酸氧化，通過反相方法確定的色氨酸氧化水平與通過體積排阻色譜法觀察到的作為預峰的色氨酸氧化量相關。SOKOLOWSKA 等[14]開發了一種高通量、自動化的亞基質量分析方法來監測抗體甲硫氨酸的氧化。在該方法中，用IdeS（IgG 降解酶）、EndoS（IgG 特異性糖苷內切酶）和二硫蘇糖醇處理樣品，生成三個單獨的IgG 亞基（輕鏈、Fd’和單鏈Fc）。通過反相超高效液相色譜結合在線四極桿飛行時間質譜儀分析這些亞基，并使用UNIFI 軟件解卷積對每個亞基上的氧化水平進行定量。該方法所需樣品量少、分析時間短，且UNIFI 軟件可以自動采集和處理數據，因此該方法可用于高通量的過程監控和產品表征。

2.2 疏水相互作用-高效液相色譜法

mAb 上氨基酸殘基的氧化可通過增加氧化形式的極性或導致構象變化而改變mAb 的疏水性。因此，通常使用基于疏水性的疏水作用液相色譜法（HIC）表征氧化mAb。BOYD 等[15]使用雙Dionex ProPac HIC-10 柱實現了最佳分離，并且將氧化的色氨酸分離為預峰，肽圖顯示氧化的色氨酸位于重鏈互補決定區中。此外，HIC 方法能夠監測互補決定區色氨酸的氧化狀態，通過HIC 檢測的互補決定區色氨酸的氧化速率與肽圖的結果直接相關。相同的方法條件也能夠分離氧化的甲硫氨酸產物，這些產物在與氧化的色氨酸不同的保留時間下作為另一個預峰共洗脫，因此HIC 可用于監測IgG1 中互補決定區色氨酸的氧化狀態。反相色譜法通常無法對其原始和修飾形式進行定量，不能充分解析帶有脫酰胺的天冬酰胺殘基和氧化甲硫氨酸殘基的肽，而疏水相互作用液相色譜法充分且可預測地將具有這些修飾的肽與其天然對應物分離。然而，疏水相互作用色譜法也存在分辨率差和色譜運行時間長等缺點。

2.3 質譜法

PERDIVARA 等[16]采用液相色譜-串聯質譜聯用技術對抗體進行表征，并用電泳分離重鏈和輕鏈。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）分離和凝膠消化后，發現一些重鏈和輕鏈上的色氨酸殘基被廣泛修飾為雙氧化的色氨酸和犬尿氨酸。相比之下，這些殘留物在溶液中酶解時沒有觀察到修飾。這些結果表明，在SDS-PAGE 分離蛋白質時色氨酸氧化可能是一種偽影，因此在使用凝膠電泳分離方法時，應關注這些偽影的存在。

AMANO 等[17]通過質譜首次發現了IgG 分子中組氨酸殘基的氧化。位于IgG1 CH2 結構域的特定組氨酸的氧化發生在光照下，但沒有在高溫下觀察到氧化。在質譜分析氘氧化物和重氧化氫中氧化的IgG1的基礎上，提出了組氨酸氧化的反應機理。

LI 等[18]開發了一種基于UV 的快速、簡單的肽圖方法，結合8 min 胰蛋白酶溶液內酶解方案用于分析氧化。能夠在1 h 內根據肽的紫外痕跡確定單抗特定殘基的氧化水平，無論是叔丁基過氧化氫（t-BHP）處理還是紫外光照的樣品。該方法可用于各種穩定性和降解研究中的單抗氧化的常規或高通量分析，并且可以潛在地作為釋放測定法實施，已成功用于檢測實時穩定性研究中抗體氧化。

WANG 等[19]報告了一種簡單、快速的自底向上液相色譜-質譜（uLC-MS）方法，只需5 min 胰蛋白酶酶解就可以同時分析多種修飾，包括氧化、脫酰胺、異構化、糖基化和N 末端焦谷氨酸的形成。與常規的前處理方法相比，uLC-MS 方法消除了酶解時間長而引發的檢測偽影。這種簡單、低偽影的多屬性uLCMS 方法可用于快速、準確地分析抗體藥物開發的任何階段的樣品，尤其適用于細胞培養過程中的克隆和培養基篩選。

2.4 氫/氘交換質譜法

為了解互補決定區內特定化學修飾對單克隆抗體屬性的影響，使用氫/氘交換質譜（HDX-MS）來研究單克隆抗體互補決定區中甲硫氨酸氧化對構象的影響。結果表明，盡管它們彼此接近，但mAb1 重鏈中CDR2 中的Asp54 異構化和Met56 氧化對局部和附近區域的構象影響相反，直接導致抗體-抗原結合親和力發生不同的改變[20]。這項研究揭示了由單克隆抗體CDR 中最常見的兩種降解途徑引起的局部和整體構象變化的直接證據，并確定了治療性單克隆抗體的化學修飾、結構和功能之間的相關性。

氫/氘交換質譜可用于評估甲硫氨酸氧化對IgG1 抗體生物學功能的影響。觀察到保守的Fc 甲硫氨酸殘基的氧化與FcRn 結合和補體依賴性細胞毒性活性的喪失之間存在線性相關性。如HDXMS 和結構模型所示，重鏈殘基Met257 和Met433 均位于FcRn 結合界面附近；然而與HC-Met433 氧化相比，HC-Met257 氧化對FcRn 結合的影響更大，HC-Met257 和HC-Met433 的氧化可以破壞CH2-CH3 界面處的蛋白質構象并防止IgG 寡聚化。HDXMS 證明了兩個互補決定區甲硫氨酸殘基的氧化對抗體的抗原結合幾乎沒有影響[21]。這些結果表明，即使翻譯后修飾水平相對較低，HDX-MS 也能有效評估單個翻譯后修飾對抗體生物學活性的影響，該方法具有高選擇性和靈敏度，是輔助評價抗體關鍵質量屬性的有價值的工具。

HAGEMAN 等[22]通過HDX-MS 表征天然和化學氧化的單克隆抗體的構象變化，并通過表面等離子體共振表征抗原-抗體結合。互補決定區內以及附近的色氨酸氧化增加了可變結構域的構象靈活性，并破壞了抗原結合。互補決定區中的色氨酸氧化會對單克隆抗體的構象和抗原結合產生不利影響，因此色氨酸氧化應作為關鍵質量屬性評估的一部分。

2.5 聯合應用

HABERGER 等[23]應用特定的反應條件，結合離子交換色譜法、蛋白水解肽圖、定量液相色譜質譜法和表面等離子體共振分析的功能評估，以識別和評估重組IgG1 的CDR 中的化學修飾位，LC（輕鏈）-Met-4、HC-Met-100c 被鑒定為潛在的關鍵質量屬性。但是，如果僅影響抗體的一條輕鏈或重鏈，則評估的降解產物不會導致功能完全喪失。

定量超高效液相色譜質譜肽圖、經典表面等離子體共振和最近開發的FcRn 柱色譜結合非變性質譜是溶液中天然狀態的蛋白質復合物分析的新方法。應用優化的質譜電壓和壓力條件來穩定氣相中的抗體/FcRn 復合物，以便隨后使用氧化的IgG1 進行非變性質譜實驗。值得注意的是，重鏈Met-265 氧化對相對結合能力的定量影響僅檢測到雙氧化IgG1，而僅具有一個氧化重鏈Met-265 的IgG1 未發現顯著影響IgG1與FcRn 的結合[24]。因此，單氧化IgG1 重鏈Met-265有可能是藥代動力學的關鍵質量屬性。

PAVON 等[25]開發了一種新穎的混合模式色譜方法，該方法使用Sepax Zenix SEC-300MK 柱的獨特性質來分析單克隆抗體氧化水平。氧化物質的分離基于樹脂和抗體之間的體積排阻和疏水相互作用的混合模式。該方法能夠將由常見氧化劑t-BHP 誘導的甲硫氨酸氧化物，由2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（AAPH）誘導的色氨酸氧化物或通過UV 光照氧化物的氧化抗體作為預峰進行解析和定量。前峰的特征在于通過LC-MS 確認為質量增加16 Da 或32 Da的氧化抗體變體，該方法已成功應用于IgG1、IgG2和IgG4 亞類的多種單克隆抗體的監測。該方法可用于監測不同位點的總體和單個氧化事件，可用作HIC的補充方法，用于開發和穩定性研究期間監測氧化。

SHI 等[26]報告了陽離子交換色譜（CEX）柱后添加有機溶劑和酸，然后在高溫下混合，從而使蛋白質展開，增加離子強度、靈敏度并促進自上而下的分析方法。過氧化氫氧化的mAb 作為模型，產生了額外的CEX 峰。在線CEX-UV-MS 自上而下的分析產生了包含一個或兩個甲硫氨酸殘基的氣相片段，氧化和非氧化碎片離子的豐度可以估算mAb 中不同甲硫氨酸殘基的氧化百分比。通過肽圖和柱上二硫鍵還原以及反相液相色譜-自上而下的質譜分析對收集的堿峰進行了證實。總體而言，結果證明了在線方法在提供電荷修飾的特定位點結構信息而無需餾分收集和費力的肽圖方面的實用性。

3 計算機模擬預測生物技術藥物氧化

雖然現有的檢測方法能夠鑒定生物技術藥物中氧化的氨基酸殘基，但這些方法大都用于藥物研發階段，而計算機模擬方法可以根據抗體序列和結構信息來預測藥物潛在的氨基酸氧化殘基。由于在藥物發現階段就可獲得抗體的序列信息，因此計算機模擬方法可在早期用于識別易氧化的氨基酸殘基，從而為進一步研究和開發藥物提供依據。

預測生物技術藥物氧化的計算機方法主要有基于序列、基于結構和基于物理三種，基于序列的方法將可變區中的所有甲硫氨酸和色氨酸殘基標記為易受影響的殘基[27]。但是由于高級結構會對氧化產生影響，基于序列的方法可能會高估氧化的風險，因為暴露的甲硫氨酸、色氨酸更容易氧化，其他的則不然。溶劑可及表面積（Solvent-Accessible Surface Area，SASA）是一個識別可能氧化的甲硫氨酸和色氨酸殘基的預測因子[28]。最近的研究成功地將分子動力學（Molecular Dynamic，MD）模擬和機器學習相結合，以預測甲硫氨酸和色氨酸氧化[29-30]。然而，影響氧化風險的特定因素可能會因潛在殘基的類型和氧化的類型而異[31]。

機器學習模型可用來識別潛在的氧化甲硫氨酸殘基。YANG 等[32]利用從隨機森林模型中得到的甲硫氨酸側鏈的SASA，確定了121 個抗體中可能氧化的甲硫氨酸殘基。他們觀察到側鏈溶劑暴露和甲硫氨酸氧化之間有很強的相關性，但存在一定的假陰性。這項研究使用了靜態晶體結構的SASA 值，但沒有發現因構象變化而引起的甲硫氨酸殘基溶劑暴露的改變。SANKAR 等[33]建立了一個隨機森林模型，結合SASA 以及硫和芳香族殘基之間的距離，預測AAPH對甲硫氨酸的氧化。

最近還有研究探索了在光照下進行甲硫氨酸氧化和AAPH 強制氧化的計算機預測。DELMAR 等[30]除了使用溶劑暴露外，還使用了丙氨酸和甲硫氨酸殘基之間的最接近原子距離作為光照下甲硫氨酸氧化的預測因子。相鄰的芳族殘基能夠起到清除游離自由基的作用，從而阻止甲硫氨酸的氧化。H2O2的強制氧化模擬了制劑中聚山梨酸酯中痕量過氧化物的暴露，而光照則是模擬了運輸、儲存過程中光暴露導致的降解[34]。因此，在不同的強制氧化（如過氧化物和光照）中，應選用不同的甲硫氨酸氧化預測因子[35]。

溶劑暴露是預測色氨酸氧化最重要的因素。SASA 的靜態結構不能捕捉到因構象改變引起的色氨酸殘基暴露，通過MD 模擬得到的SASA 平均值可以更精確地預測色氨酸的氧化。由于吲哚環的氧化是犬尿氨酸形成過程中的重要環節，因此色氨酸側鏈的溶劑暴露可以作為一個重要的預測因子[36]。當色氨酸主鏈被包裹而側鏈暴露時，SASA 能精確地預測氧化。SHARMA 等[29]發現色氨酸的側鏈SASA 與AAPH 孵育后的色氨酸氧化有很大的關系。DELMAR等[30]開發了一種隨機森林模型，它將二級結構與psi和phi 角相結合，用于預測光照下的色氨酸氧化。在此基礎上，未來可以進一步探討其他結構因子對色氨酸氧化的影響，根據特定應激條件，例如高溫、光照、AAPH、過氧化物與痕量金屬結合的強制氧化對色氨酸氧化進行計算機預測。

4 結語

氧化是一種常見的蛋白質翻譯后修飾，通常發生于抗體的制備與貯存過程中。由于各位點的氧化程度較低，所以采用強制氧化方法來確定氧化位點。氧化修飾位點會對其生物活性產生一定的影響，使其產生抗體特異性。要保證治療用藥的安全、有效，就必須研究和優化細胞培養、制劑和貯存的相關條件。在生物技術藥物研發的早期階段中，可使用各種計算機模擬工具預測藥物潛在的氧化位點，隨后模擬在不同生產步驟中遇到的各種條件下進行加速穩定性研究，從而篩選和設計出穩定的藥物。未預測到潛在的氧化位點需要花費大量的時間和代價來補救，而錯誤的預測易氧化的位點則會導致藥物的過度設計，因此在使用計算機模擬預測氧化時應根據具體的研究情況選擇合適的預測方法。目前國內對生物技術藥物中氧化的檢測項目很少，而且對其氧化產物的含量限值也沒有規定，有關的定性和定量分析方法更是一片空白。建立高效、準確測定生物技術藥物中氧化產物的方法，尤其是含量測定方法，將其與國際接軌，對生物技術藥品的生產和市場流通進行有效的監督，可以更好地保護人們的生命，規范藥品的使用。隨著氧化檢測技術的發展，如何使其更好地用于臨床檢驗，建立高效、準確的質量標準是一個值得思考的問題。