高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定坤泰膠囊中7 種成分含量

巫 悅

（東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北院區(qū)，江蘇 南京 211500）

坤泰膠囊是由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、阿膠和茯苓6 味藥材組方的中藥復(fù)方制劑，具有滋陰清熱、安神除煩功效。用于絕經(jīng)期前后諸證陰虛火旺者，潮熱面紅、自汗盜汗、心煩不寧、失眠多夢(mèng)、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、手足心熱、卵巢功能衰退更年期綜合征見(jiàn)上述證候者，現(xiàn)收載于2020年版《中國(guó)藥典（一部）》，以黃芩中的黃芩苷［1］314和黃連中的鹽酸小檗堿［1］316為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。目前，關(guān)于坤泰膠囊的其他指標(biāo)成分含量測(cè)定的研究較少，多為臨床應(yīng)用研究［2-4］。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，藥效的發(fā)揮往往是多種活性成分相互作用的結(jié)果，故多成分測(cè)定可更準(zhǔn)確、全面地評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑的內(nèi)在質(zhì)量。2020年版《中國(guó)藥典（一部）》中對(duì)熟地黃［1］130、白芍［1］108、黃連和黃芩分別以地黃苷D、芍藥苷、鹽酸小檗堿和黃芩苷作為指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制。結(jié)合文獻(xiàn)［5 - 9］，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定坤泰膠囊中地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷7 種成分含量的高效液相色譜法，以為進(jìn)一步完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司），配有2996型PDA檢測(cè)器；AB-135S型電子分析天平（瑞士Mettler - Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為50 kHz）。

1.2 試藥

坤泰膠囊（貴陽(yáng)新天藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為210415，210622，210617）；地黃苷D 對(duì)照品（批號(hào)為112063 - 202103，純度為94.2%），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-202015，純度為85.9%），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736/ 202145，純度為94.6%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-202122，純度為94.2%），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595-201808，純度為97.9%），沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110831-201906，純度為91.5%），毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)為111530 - 201914，純度為95.2%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～12 min時(shí)35%A～45%A，12～35 min 時(shí)45%A，35～47 min 時(shí)45%A～53%A，47～60 min 時(shí)53%A～35%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm（地黃苷D、黃芩苷、鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸、黃芩素），230 nm（芍藥苷），338 nm（毛蕊花糖苷）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

取地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷對(duì)照品各適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液超聲（功率為500 W，頻率為50 kHz）使溶解并定容，配制成地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為0.300 5，0.527 0，0.260 4，0.840 3，0.184 6，0.095 1，0.080 3 mg/mL 的混合對(duì)照品貯備液。精密量取上述混合對(duì)照品貯備液4 mL，置20 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液定容，搖勻，濾過(guò)，即得混合對(duì)照品溶液。

取樣品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為50 kHz）40 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

按樣品處方工藝，分別制備缺熟地黃、黃連、白芍、黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，該色譜條件下地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷色譜峰基線分離良好，7 種成分色譜峰的對(duì)稱因子分別為0.93，1.02，0.98，1.05，1.04，0.96，1.06，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Gallic acid 2.Paeoniflorin 3.Rehmannioside D 4.Baicalin 5.Verbascoside 6.Berberine hydrochloride 7.BaicaleinA.Mixed reference solution B.Test solution C-F.Negative reference solution（lack of Rehmanniae Radix Praeparate，Coptidis Rhizoma，Paeoniae Radix Alba，and Scutellariae Radix respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，15.0 mL，分別置20 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液定容，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為210415）樣品適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜峰。結(jié)果地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.32%，1.24%，0.85%，0.67%，0.94%，1.03%，0.77%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為210415）樣品適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算各成分含量及RSD。結(jié)果地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷的平均含量分別為6.235 4，11.3206，5.2368，17.4935，3.6529，1.9561，1.5637mg/g，RSD分別1.43%，0.93%，1.12%，0.85%，1.32%，0.74%，0.69%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為210415）樣品，依法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24 h 時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為0.66%，0.79%，1.11%，1.07%，1.34%，0.68%，1.41%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為210415）0.25 g，精密稱定，共6份，分別置錐形瓶中，精密加入含地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為2.905 2，5.242 6，2.512 8，8.472 0，1.814 8，0.926 6，0.802 4 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液0.5 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算7 種成分的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批（批號(hào)分別為210415，210622，210617）樣品各適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行2 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸及毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中7種成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.3 Results of the content determination of seven components in samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

地黃是四大懷藥之一。生地黃炮制而成的熟地黃，性由寒轉(zhuǎn)溫，味由苦轉(zhuǎn)甘，功效由清轉(zhuǎn)補(bǔ)，以滋陰補(bǔ)血、益精填髓為主，毛蕊花糖苷和地黃苷D 是其特征性成分［10］。黃芩為常用大宗中藥材，黃酮類化合物黃芩苷和黃芩素為其特征成分，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效［11］。芍藥苷是白芍的藥效物質(zhì)，沒(méi)食子酸等酚酸類成分具有顯著的抗炎、抗腫瘤等藥理作用，常作為白芍藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分［6］。黃連可瀉肝火，去心竅惡血，止驚悸，其藥用價(jià)值與其所含生物堿類成分密切相關(guān)，其中小檗堿是含量最豐富、最具代表性的化合物［12］。本研究中最終確定以地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸及毛蕊花糖苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.2 提取條件優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中考察了不同的提取方式、提取時(shí)間、提取溶劑和料液比對(duì)7 種成分提取效果的影響。超聲處理（功率為500 W，頻率為50 kHz）［13］和加熱回流［14］均能提取完全，考慮超聲操作更簡(jiǎn)便，最終選擇超聲提取。以7種成分的色譜峰峰面積大小作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同超聲時(shí)間（30，40，60 min）對(duì)提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)超聲40 min 時(shí)各成分峰面積趨于穩(wěn)定?？疾觳煌w積分?jǐn)?shù)（50%，80%，100%）乙醇，不同體積分?jǐn)?shù)（50%，80%，100%）甲醇及水作為提取溶劑時(shí)對(duì)提取效果的影響［13-15］，結(jié)果80%甲醇和甲醇提取效率較高，最終選擇80%甲醇作為提取溶劑。考察了不同料液比（1∶50，1∶100，1∶200，m/V）對(duì)提取效果的影響［14-16］，結(jié)果料液比為1∶50時(shí)提取不充分，料液比為1∶100和1∶200時(shí)可充分提取，從節(jié)約成本的角度考慮，最終選擇料液比1∶100。故樣品的處理最終以料液比1∶100 的80%甲醇超聲（功率為500 W，頻率為50 kHz）40 min，操作簡(jiǎn)便，且提取充分。

3.3 色譜條件優(yōu)化［17-20］

采用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描混合對(duì)照品溶液，結(jié)果地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、沒(méi)食子酸、毛蕊花糖苷分別在278，265，230，272，338 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩苷和黃芩素在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。但頻繁的波長(zhǎng)切換，會(huì)導(dǎo)致基線較大幅度漂移。最終采用在230 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)芍藥苷，在275 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)地黃苷D、鹽酸小檗堿、沒(méi)食子酸、黃芩苷和黃芩素，在338 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)毛蕊花糖苷，既避免了波長(zhǎng)的頻繁切換造成基線不平穩(wěn)，又保證了7 種成分均有適宜的靈敏度，分離度較好，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

7 種成分極性差異較大，故采用梯度洗脫。分別考察甲醇- 水溶液、乙腈- 水溶液作為流動(dòng)相時(shí)各成分的色譜峰，結(jié)果沒(méi)食子酸存在拖尾現(xiàn)象，流動(dòng)相為甲醇- 水溶液時(shí)地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、毛蕊花糖苷的分離效果溶液優(yōu)于乙腈- 水溶液。預(yù)試驗(yàn)中通過(guò)加入不同濃度的磷酸改善沒(méi)食子酸色譜峰的峰形，比較了甲醇- 0.1%磷酸溶液、甲醇- 0.2%磷酸溶液、甲醇- 0.4%磷酸溶液，結(jié)果無(wú)明顯差異，最終流動(dòng)相選擇甲醇- 0.1%磷酸溶液，7 種指標(biāo)成分在60 min 內(nèi)均可洗脫完全。曾考察25 ℃和30 ℃2 個(gè)柱溫對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果柱溫為30 ℃時(shí)毛蕊花糖苷與相鄰雜質(zhì)峰分離較佳，最終選擇柱溫為30 ℃。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能同時(shí)測(cè)定坤泰膠囊中地黃苷D、鹽酸小檗堿、芍藥苷、黃芩苷、黃芩素、沒(méi)食子酸及毛蕊花糖苷7種指標(biāo)成分的含量。