天麻素抗偏頭痛作用機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接研究*

楊 杰，郭步伐，龍 盼，李 沙

（畢節(jié)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，貴州 畢節(jié) 551700）

天麻素是天麻的主要有效成分，是天麻質(zhì)量控制的指標(biāo)性化合物，具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗驚厥、神經(jīng)保護、改善學(xué)習(xí)記憶、降壓、抗凝、抗血小板聚集等藥理作用［1-2］。這與天麻祛風(fēng)通絡(luò)、平抑肝陽、息風(fēng)止痙的功效密不可分，臨床可用于治療偏頭痛。回顧經(jīng)典的中醫(yī)古方，治療偏頭痛頻次達50 次以上的中藥為川芎、白芍、天麻、當(dāng)歸、白芷和甘草，故天麻主要成分天麻素治療偏頭痛的臨床價值值得進一步挖掘［3］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一門分支學(xué)科，可從整體觀角度闡釋中藥及中藥復(fù)方治療疾病的關(guān)鍵分子通路［4-7］。本研究中以天麻主要有效成分單體天麻素為核心展開研究，遵循《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》［8］，在天麻素治療偏頭痛療效確切的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)篩選天麻素抗偏頭痛的關(guān)鍵分子通路及關(guān)鍵靶點，為臨床應(yīng)用提供分子機制基礎(chǔ)。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

收集天麻素抗偏頭痛靶點：在TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：// old. tcmsp. e. com/ index. php）中獲取天麻素的化學(xué)結(jié)構(gòu)；在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（https：//www.SwissTargetPrediction.cn/）中選擇的物種為“人”，獲取天麻素的作用靶點，以靶基因的縮寫表示；在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：// www. genecards. org/）中以“migraine”為關(guān)鍵詞搜索偏頭痛相關(guān)靶點，通過R 3.6.2 軟件繪制維恩圖，取天麻素靶點與偏頭痛相關(guān)靶點的交集，即得天麻素抗偏頭痛共有靶點。

構(gòu)建蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)（天麻素抗偏頭痛靶點網(wǎng)絡(luò)）：將分析得到的天麻素抗偏頭痛靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https：// www. string - db. org/），選擇物種為“人”，輸出天麻素抗偏頭痛靶點網(wǎng)絡(luò)圖，保存.tsv 格式文件，并輸入R 3.6.2 軟件，進行條形圖分析，并計算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點自由度值，揭示其核心靶點。

GO 生物過程富集分析與KEGG 通路富集分析及靶點- 通路網(wǎng)絡(luò)：通過R 3.6.2 軟件，將天麻素抗偏頭痛靶點基因的縮寫轉(zhuǎn)換為基因ID，經(jīng)R 3.6.2 軟件進行GO 生物過程富集分析與KEGG 通路富集分析，篩選富集P值較顯著的信號通路，并用條形圖表示。從上述分析中篩選出富集顯著的20 條信號通路與30 個靶點，經(jīng)Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建靶點- 通路網(wǎng)絡(luò)，體現(xiàn)天麻素治療偏頭痛多靶點、多途徑的整體效應(yīng)。

1.2 分子對接驗證

經(jīng)PPI 網(wǎng)絡(luò)與靶點- 通路網(wǎng)絡(luò)共同顯示天麻素抗偏頭痛核心靶點，并進行天麻素與核心靶點的分子對接驗證，其操作過程如下。1）經(jīng)Chem3D 軟件，將天麻素2D 結(jié)構(gòu)（. sdf 格式文件）轉(zhuǎn)化為3D 結(jié)構(gòu)（. mol2 格式文件）；2）在PDB 數(shù)據(jù)庫（http：// www. rcsb. org/）中下載靶點3D結(jié)構(gòu)（.pdb格式文件），并經(jīng)PyMOL 軟件去除水分子和小分子配體；3）在AutoDockTools 1.5.6 軟件中導(dǎo)入靶點的3D 結(jié)構(gòu)，輸出. pdbqt 格式文件，輸入天麻素.mol2 格式文件，導(dǎo)出天麻素.pdbqt 格式文件，運行Grid 模塊，設(shè)置天麻素與靶點對接的活性口袋；4）運行AutoDock_vina 1.1.2 分子模擬軟件進行分子對接，用結(jié)合能評價化合物與受體的匹配情況，用PyMOL 軟件繪制最佳匹配結(jié)果圖。

2 結(jié)果

2.1 天麻素抗偏頭痛靶點

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞“migraine”搜索到偏頭痛相關(guān)靶點3 081 個，并與103 個天麻素作用靶點取交集，得到天麻素抗偏頭痛共有靶點50個。詳見圖1。

圖1 天麻素與偏頭痛共有靶點的維恩圖Fig.1 Venn diagram of common targets of gastrodin and migraine

2.2 構(gòu)建天麻素抗偏頭痛靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)

將50個共有靶點輸入String數(shù)據(jù)庫，得到天麻素抗偏頭痛靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)，提示靶點與靶點的相互作用。靶點相互作用的節(jié)點數(shù)越多，自由度值越高，表明該靶點在此網(wǎng)絡(luò)中所處核心地位就越高。自由度值排前30的靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)條形圖見圖2。

圖2 天麻素抗偏頭痛靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)條形圖Fig.2 PPI network histogram of targets related to gastrodin against migraine

2.3 GO 生物過程富集、KEGG 通路富集及靶點- 通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

GO 生物過程富集分析顯示（圖3），富集P值較顯著的生物過程為內(nèi)肽酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、水裂解酶活性、碳氧裂解酶活性、裂解酶活性、金屬內(nèi)肽酶活性、涉及細胞凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、胰島素樣生長因子Ⅰ結(jié)合、寡聚糖，結(jié)合的富集靶點數(shù)量分別為10個、8個、8個、8個、8個、5 個、4 個、3 個、3 個、3 個。進一步對50 個天麻素抗偏頭痛靶點進行KEGG 通路富集分析（圖4），結(jié)果顯示，富集P值較顯著的信號通路為氮代謝信號通路和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化，富集靶點數(shù)量分別為8 個、12 個。這2 條信號通路富集的靶點基因數(shù)量為20 個，占天麻素抗偏頭痛靶點數(shù)量的40.00%，可被認為是天麻素治療偏頭痛的關(guān)鍵分子通路。

圖3 天麻素抗偏頭痛靶點的GO生物過程富集分析條形圖Note：Red refers to the biological process with more significant enrichment P-values.Fig.3 Bar chart of GO biological process enrichment of targets related to gastrodin against migraine

圖4 天麻素抗偏頭痛靶點的KEGG通路富集分析條形圖Note：Red refers to the signaling pathway with more significant enrichment P-values.Fig.4 Bar chart of KEGG pathway enrichment of targets related to gastrodin against migraine

基于富集P值較顯著的2 條信號通路，氮代謝信號通路富集的靶點基因為不同亞型的碳酸酐酶（CA），脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路富集的靶點基因主要包含如下3個方面。1）基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-9、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（CASP）1、CASP3、CASP8、磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）等損傷、細胞凋亡相關(guān)靶基因；2）E - 選擇素（SELE）、P - 選擇素（SELP）等單核細胞激活相關(guān)靶基因；3）PI3K、糖原合酶激酶-3β（GSK3β）等細胞增殖過程相關(guān)靶基因。

通過Cytoscape軟件將富集顯著的20條KEGG 信號通路與30個靶點構(gòu)建為靶點-通路網(wǎng)絡(luò)（圖5），結(jié)果顯示，每條通路平均與6.15個靶點產(chǎn)生交互作用，每個靶點平均與3.84 條信號通路產(chǎn)生交互作用，體現(xiàn)了中藥成分治療疾病的多靶點、多途徑效應(yīng)，與中醫(yī)學(xué)的整體觀念不謀而合。

圖5 天麻素抗偏頭痛靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network of targets-pathway related to gastrodin against migraine

2.4 分子對接結(jié)果

將氮代謝、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等KEGG信號通路富集的20個靶點基因與PPI網(wǎng)絡(luò)條形圖中顯示的30個靶點基因相對應(yīng)，取重疊的14 個靶點基因與天麻素進行分子對接驗證。以分子對接結(jié)合能的絕對值作為評價對接驗證結(jié)果的指標(biāo)，當(dāng)分子對接結(jié)合能絕對值高于7 kcal/mol時，表明結(jié)合能力高。同時，采用臨床治療偏頭痛的常見藥物氟桂利嗪進行對照。結(jié)果天麻素與偏頭痛相應(yīng)靶點對接結(jié)合能絕對值均低于氟桂利嗪與偏頭痛靶點對接結(jié)合能絕對值，天麻素與CA1，CA9，MMP - 9，CASP1 靶點的對接結(jié)合能絕對值高于7.5 kcal/mol。結(jié)果見表1。天麻素、氟桂利嗪與CA1 和CA9靶點的分子對接模擬圖見圖6。

圖6 天麻素、氟桂利嗪與CA1和CA9的分子對接模擬圖A.Docking of flunarizine with CA1 B.Docking of flunarizine with CA9 C.Docking of gastrodin with CA1 D.Docking of gastrodin with CA9Fig.6 Molecular docking simulation graph of gastrodin and fluranazine with CA1 and CA9

表1 天麻素、氟桂利嗪與相應(yīng)偏頭痛靶點基因的分子對接結(jié)果Tab.1 Molecular docking results of gastrodin，flunarizine and corresponding migraine targets-related genes

3 討論

偏頭痛是一種周期性反復(fù)發(fā)作、纏綿難愈的頭痛疾病，疼痛發(fā)作時難以忍受，嚴(yán)重影響患者的日常生活。目前，其治療以鈣通道阻滯劑（氟桂利嗪或尼莫地平）為核心，聯(lián)用天麻素的臨床總有效率達90%以上［9-10］。天麻素通過多靶點、多途徑治療偏頭痛。首先，天麻素及其衍生物通過抑制三叉神經(jīng)激活，進而抑制三叉神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)脊束尾側(cè)核血清降鈣素基因相關(guān)肽的釋放，降低一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1 等血管活性因子的表達水平，既可調(diào)節(jié)血管功能，也可通過降低血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素1β、白細胞介素18等炎性因子水平而抑制神經(jīng)源性炎性反應(yīng)［11-17］。其次，天麻素通過降低氧化型低密度脂蛋白水平，改善偏頭痛患者氧化應(yīng)激水平，防止線粒體氧化應(yīng)激損傷，減少凋亡小體的產(chǎn)生，從而下調(diào)細胞凋亡基因CASP 的表達［18］。最后，神經(jīng)遞質(zhì)傳遞異常是偏頭痛發(fā)生的主要機制之一，如5-羥色胺是偏頭痛發(fā)作時神經(jīng)功能異常的主要神經(jīng)遞質(zhì)，天麻素通過升高血清5-羥色胺水平而改善神經(jīng)功能紊亂［18］。

研究表明，偏頭痛患者血清中MMP-9表達水平會明顯升高［19-20］。CASP1涉及細胞凋亡過程，也可觸發(fā)炎癥［21-22］，為偏頭痛神經(jīng)源性炎癥標(biāo)志物。CA表達上調(diào)，可參與細胞遷移、CO2/NO 穩(wěn)態(tài)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及偏頭痛患者神經(jīng)功能異常、神經(jīng)源性炎癥、血管功能異常等密切相關(guān)［14，23］。由圖4可知，天麻素抗偏頭痛靶點富集較顯著的2條信號通路為氮代謝和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化。由表1可知，上述信號通路直接相關(guān)的基因為CA1，CA9，CASP1，MMP-9等。分子對接結(jié)果顯示，天麻素與上述基因的分子對接結(jié)合能絕對值均高于7.5 kcal/mol，對接良好，表明上述基因可成為天麻素抗偏頭痛的主要靶點。

綜上所述，天麻素可能通過調(diào)控氮代謝和脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路，影響CA，MMP，CASP 等靶點基因的表達，從而治療偏頭痛，但其具體作用機制有待后續(xù)實驗證實。