Box-Behnken 響應面法優化阿托伐他汀鈣類脂囊泡處方工藝

李東澤，付 琳，任書杉，王 超，張向宇

（佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007）

阿托伐他汀鈣（ATC）廣泛用于治療高脂血癥，通過將β-羥［基］-β-甲戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）轉化為甲戊酸［1］以抑制膽固醇的生物合成，降低血液中膽固醇、低密度脂蛋白和三酰甘油的水平。但其水溶性差，生物利用度低，體內半衰期短，消除速率快，單次大劑量口服可能導致肝功能異常及腎功能衰竭［2］，限制了臨床應用。故需應用類脂囊泡藥物遞送系統［3］、自乳化藥物遞送系統［4］、口腔黏膜給藥系統［5］、胃滯留緩釋給藥系統［6］、局部透皮給藥系統［7］、聚合物納米粒［8］等新型給藥系統，以改善ATC的疏水性，提高生物利用度。類脂囊泡是由非離子表面活性劑和膽固醇或膽固醇衍生物構成的類脂質雙分子層球囊結構，具備包封親水性和親脂性物質的能力［9-10］。類脂囊泡生物膜相容性良好［11］，可避免藥物在到達有效位點前被破壞，延長藥物半衰期，并起到被動靶向的作用［12-13］。響應面法是以數理統計為基礎，對設計點及因素進行數學建模集合，得到約束目標函數的響應面模型，進一步預測非試驗點響應值的試驗優化方法，包括中心組合設計、全因素設計、Box - Behnken 設計等。Box - Behnken 響應面法優化的擬合模型準確、可靠［14-15］，在各參數離散水平影響下得到最佳的條件組合及對應的最優響應值，廣泛用于醫學、生物、化學等行業［16-18］。β- 谷甾醇是一種膳食植物甾醇［19］，具備與膽固醇相似的化學結構和可生物降解的性能，在生物制藥領域中常作為膽固醇的替代物用于藥用輔料。本研究中采用薄膜-超聲分散法［20］制備以β- 谷甾醇和Span60 為囊材、包載ATC 的類脂囊泡（ATC-NIS），采用Box-Behnken 響應面法優化處方工藝，分別從外觀形態、粒徑分布、包封率、載藥量、體外釋放性能等方面進行評價，以得到ATC-NIS 的最佳制備工藝及處方。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FA2004N 型電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司，精度為萬分之一）；TGL - 16GB 型臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；UV765 型紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ - 400KB 型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為220 W）；JY92 - 2D 型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率為900 W）；DF - 101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試藥

ATC 原料藥（武漢遠成共創科技有限公司，批號為J1203AS）；Span60（大連美侖生物技術有限公司，批號為O1013A）；β- 谷甾醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為S111182，含量＞95%）；乙腈、甲醇（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；醋酸銨、醋酸（天津凱通化學試劑有限公司）；透析袋（美國Union Carbide公司）。

2 方法與結果

2.1 類脂囊泡制備

采用薄膜-超聲分散法制備。稱取處方量的ATC、Span60和β-谷甾醇，溶于3.0 mL氯仿-甲醇（4∶1，V/V）的混合溶劑中，超聲（功率為88 W）使分散均勻，置旋轉蒸發儀65 ℃、減壓蒸發至有機溶劑揮發完全，在圓底燒瓶內形成均一的透明薄膜，加入同溫適量蒸餾水，靜置孵育30 min后，置恒溫磁力加熱攪拌器（轉速為100 r/min）65 ℃加熱條件下水化1.0 h，得ATC-NIS 混懸液，轉移至超聲波細胞破碎機超聲處理（功率為200 W）5 min，即得ATC-NIS。

2.2 ATC 體外分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：醋酸銨緩沖液（醋酸調pH至4.5）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：246 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 方法學考察

專屬性試驗：分別取類脂囊泡和ATC - NIS，加入10倍體積甲醇超聲（功率為200 W）處理2 min，溶解，使類脂囊泡破碎，分別過0.22 μm有機相微孔濾膜，備用。加等量標準貯備液（質量濃度為5 μg/mL），按2.2.1項下色譜條件進樣測定，并根據出峰情況考察藥物與類脂囊泡的特性。空白類脂囊泡對ATC 測定無干擾，ATC保留時間為5.20 min，理論板數、拖尾因子等均符合要求，特征峰與其他成分峰間的分離度均大于1.5，表明方法專屬性強。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

線性關系考察：取ATC 適量，用甲醇溶解，并分別稀釋為質量濃度為5，10，15，20，30，40，50 μg/mL 的標準貯備液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=48.187C-74.23（R2=0.999 9，n=7）。結果ATC 質量濃度在5～50 μg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：精密量取ATC 供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖的信噪比（S/N），分別以S/N為10 和3 時的進樣量確定最低定量限和最低檢測限。結果ATC 最低定量限和檢測限分別為0.617 ng和0.184 ng。

精密度試驗：分別取等體積10，20，40 μg/mL 不同質量濃度的ATC供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，每日進樣5次，計算日內精密度；另在每日同一時間內進樣1 次，連續進樣5 d，計算日間精密度。結果見表1，表明儀器精密度良好。

表1 日內和日間精密度試驗結果（n=5）Tab.1 Results of intra-day and inter-day precision tests（n=5）

加樣回收試驗：取精密度試驗項下不同質量濃度的ATC 供試品溶液，分別加入空白類脂囊泡液5.0 mL，經適量甲醇稀釋得3 種質量濃度貯備液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定3 次，記錄峰面積，代入線性回歸方程，經計算得3種質量濃度下的加樣回收率分別為（100.65±0.84）%，（100.52±0.62）%，（100.38±0.67）%，RSD分別為0.84%，0.62%，0.67%（n=3），表明方法準確度好。

2.3 包封率與載藥量測定

量取2.1 項下ATC-NIS 混懸液1.0 mL，置離心管中離心（轉速為10 000 r/ min）10 min，棄上清液，加蒸餾水重新分散清洗沉淀2 次，加適量甲醇溶解沉淀，轉移至25.0 mL 容量瓶中，定容，過0.22 μm 有機相濾膜，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，帶入線性回歸方程計算游離藥物量，按公式計算ATC-NIS 的包封率及載藥量。包封率（%）=（投藥量- 游離藥物量）/投藥量×100%，載藥量（%）=囊泡內包封藥物量/囊泡質量×100%。

2.4 工藝與處方因素水平確定

超聲時間：按2.1項下方法制備ATC-NIS，固定其他因素不變。只改變超聲時間［21］，設定超聲功率為200 W，超聲時間分別為5，8，10，12，15 min，考察超聲時間對類脂囊泡包封率的影響。超聲時間的長短會直接影響類脂囊泡的粒徑及包封率的大小，超聲時間過久可能會破環類脂囊泡的結構而使藥物泄露。由圖2 A可知，經單因素試驗確定超聲時間范圍為10～15 min。

Span60 與ATC 質量比：按2.1 項下方法制備ATCNIS，固定其他因素不變。只改變Span60 與ATC 質量比［22］，設定處方內Span60 添加量為0.086 g，比例分別為4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1，考察Span60與ATC的比例對類脂囊泡包封率的影響。藥脂比是類脂囊泡構成的關鍵因素，非離子表面活性劑起支撐作用，影響類脂囊泡的構型，從而影響藥物的包封率。由圖2 B 可知，經單因素試驗確定Span60 與ATC 質量比在6∶1～8∶1 范圍內存在最優比例。

β- 谷甾醇添加量：按2.1 項下方法制備ATC -NIS，固定其他因素不變。考察當β-谷甾醇添加量分別為6，8，10，12，14 mg 時對類脂囊泡包封率的影響。β-谷甾醇在類脂囊泡中起膜穩定劑的作用［23］，使雙層膜結構更加緊密，防止藥物泄露，提高包封率。由圖2 C 可知，經單因素試驗確定β-谷甾醇添加量為10～14 mg。

圖2 不同處方單因素對ATC-NIS包封率的影響（n=3）A.Ultrasound time B.Span60∶ATC（m∶m） C.Addition amount of β-sitosterolFig.2 Effect of different prescription factors on the encapsulation efficiency of ATC-NIS（n=3）

2.5 Box-Behnken 響應面法優化處方

優化編碼及水平：經單因素試驗確定影響ATC -NIS 制備過程中較顯著的3 個因素的3 個水平，采用Box - Behnken 響應面法優化處方，以包封率為評價指標，考察Span60∶ATC（因素A）、β- 谷甾醇加水量（因素B）、超聲時間（因素C）對類脂囊泡包封率的影響。試驗因素與水平見表2，結果見表3。

表2 Box-Behnken響應面法因素與水平Tab.2 Factors and levels of the Box-Behnken response surface methodology

表3 Box-Behnken響應面法試驗設計與結果Tab.3 Experimental design and results of the Box-Behnken response surface methodology

多元二次回歸方程建立：經Design - Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行回歸分析，得二次多元回歸方程Y= 74.41 - 0.067 5X1+ 1.13X2-1.39X3+0.432 5X1X2+1.64X1X3+2.31X2X3-9.20X12-8.96X228.12X32（R2=0.993 6，P＜0.01）。由表4 可知，數學模型擬合良好，預測數據可靠，可信度高，失擬項P值大于0.05，表明模型預測值與實測值差異較小。

表4 ATC-NIS包封率回歸模型系數的方差分析結果Tab.4 ANOVA results of encapsulation efficiency regression model coefficient of ATC-NIS

優化預測：由試驗結果可知，影響因素中顯著性大小為C ＞B ＞A，根據優化目的，將包封率設為最大，通過Design-Expert 8.0.6 軟件繪制不同影響因素對于各指標的三維響應面圖，結果見圖3。得到優化后的處方為Span60∶ATC為7∶1（m/m），β-谷甾醇添加量為12 mg，超聲時間為12 min。按優化的最優處方工藝，平行制備3批ATC-NIS，所得包封率為（75.36±1.17）%（n=3），載藥量為（7.95 ± 0.42）%（n= 3）。與包封率預測值74.6%接近，說明所建立的方法預測性良好。

圖3 各影響因素對ATC包封率影響的三維響應面圖Fig.3 3D response surface of various influencing factors on encapsulation efficiency of ATC

2.6 ATC-NIS 的體外質量評價

粒徑分布及Zeta 電位測定：取ATC - NIS 適量，精密稱定，加蒸餾水按1∶1比例稀釋，使其分散均勻，使用激光粒度分析儀測量平均粒徑、多分散系數（PDI）和Zeta電位，重復3次。ATC-NIS粒徑為（211.81±1.05）nm，PDI為0.199±0.013，Zeta電位為（-38.24±0.105）mV。詳見圖4和圖5。

圖4 ATC-NIS粒徑分布Fig.4 Distribution of particle size of ATC-NIS

圖5 ATC-NIS Zeta電位圖Fig.5 Zeta-potential of ATC-NIS

外觀形態：采用磷鉬酸負染色法制備透射電鏡樣品，取少量ATC-NIS，加雙蒸水稀釋后滴在銅網上，室溫干燥，滴加2.0%磷鎢酸染液負染色，室溫下孵育過夜，晾干，在透射電子顯微鏡下觀察ATC - NIS 的微觀形態。結果ATC-NIS 相對分散無聚集，呈大小均一、表面光滑的類球形。詳見圖6。

圖6 ATC-NIS透射電子顯微鏡整體形態（×10 000）Fig.6 Overall morphology of the transmission electron microscope of ATC-NIS（×10 000）

體外釋放行為考察：考察ATC-NIS 在磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）中的釋放行為［24］，首先取等體積ATC-NIS和ATC 溶液適量，置透析袋中，兩端扎緊，將透析袋浸入900.0 mL 含有0.5% SDS 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）釋放介質中，置恒溫水浴搖床振蕩，溫度保持在（37 ±0.5）℃，攪拌速率為90 r/min，于0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，12.0，24.0，36.0，48.0 h 時收集樣品3.0 mL，同時添加等體積新鮮釋放介質，采集的樣品經0.22 μm濾膜濾過，適當稀釋，并按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，分析每個時間點的藥物含量，并以ATC原料藥為參比制劑進行試驗，重復5次。計算各時間點的累積釋放率，繪制ATC 和ATC-NIS 的釋放曲線。由圖7 可知，ATC 在5.0 h 內釋放96.77%以上，而ATC-NIS在48.0 h內可穩定、長效地持續釋放。

圖7 ATC-NIS在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的體外釋放情況（n=5）Fig.7 Release profiles in vitro of ATC-NIS in pH 6.8 PBS（n=5）

3 討論

類脂囊泡是具備優良生物相容性的藥物載體，其特殊的雙層類脂質膜結構可將疏水性成分ATC 包載于壁層。本研究中制備ATC - NIS，經單因素篩選Span60與ATC 質量比可知，隨著投藥量的增加，包封率呈現先增大后減小的趨勢，推測是由于投藥量增加使囊材所包覆藥物量增大，囊泡體系黏度增加，但當投藥量持續增大時，囊材的包載能力達到臨界值后會引起漏藥，包封率減小。

因3個影響因素間存在交互作用，采用Box-Behnken響應面法優化ATC-NIS的制備工藝，經Design-Expert構建數學模型響應面圖，因素影響大小為超聲時間＞β-谷甾醇添加量＞Span60∶ATC（m∶m）。超聲時間對包封率的影響最顯著，隨著超聲時間的增大，包封率先增大后減小，可能是超聲使囊泡粒子均勻分散在外水相溶液中，但超聲時間過長會使囊泡粒子破裂，導致包封藥物滲出，從而降低包封率。

β-谷甾醇作為類脂囊泡中的膜穩定劑，與類脂囊泡的包封率關系密切，隨著添加量的增加，膜材由堅實變得柔軟且富有彈性，為類脂囊泡提供了較強的流動性，藥物更穩定地包載于囊材中，不易破裂，但添加過量時會導致囊材流動性過大，使ATC - NIS 不易成型，從而降低包封率。

對所優化的最優處方進行模擬體外釋放顯示，ATC-NIS 可顯著減緩ATC 的釋放。激光粒度儀分析顯示，ATC - NIS 粒徑分布均勻，通過透射電子顯微鏡觀察ATC-NIS 的形態特征為球形或類球形。綜合分析表明，薄膜分散法結合超聲的應用可有效減小NIS的粒徑大小，降低粒子間的聚集，Box-Behnken 響應面法優化ATC - NIS 準確可靠、高效可行，得到具備緩釋效果的ATC-NIS，為后期試驗奠定了制劑學基礎。