二甲雙胍對急性肺損傷細胞凋亡、遷移和上皮-間質轉化的影響及機制研究

歐陽運萍，陳濤，李鵬，趙博，楊小軍

急性肺損傷屬于臨床嚴重呼吸系統疾病之一，具有高發病率和高死亡率，是臨床許多危重疾病患者發生急性呼吸衰竭的重要原因［1］。目前，臨床上急性肺損傷的治療手段對于提高患者生存質量效果不佳，因此尋求治療急性肺損傷的有效手段具有重要意義。二甲雙胍是臨床廣泛用于治療糖尿病的藥物，其療效及安全性已得到充分證實。研究發現，二甲雙胍在減輕肺損傷方面具有一定作用［2］，包括對脂多糖誘導的急性肺損傷［3］。但二甲雙胍對氧化應激造成急性肺損傷的作用機制研究較少。既往研究顯示，二甲雙胍與p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路關系密切［4］。p38 MAPK是人體關鍵細胞內信號通路之一，可參與多種呼吸系統疾病的發生與發展［5］。近年來有p38 MAPK信號通路與急性肺損傷、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等常見呼吸系統疾病相關的報道［6］。另有研究顯示，p38 MAPK信號通路參與了上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）進程［7］。Ⅱ型肺泡上皮細胞是氧化損傷的主要靶點，其特點是較難分離獲取且難以在體外傳代［8］。而人肺泡上皮細胞與Ⅱ型肺泡上皮細胞的形態及生化特性相似，因而本實驗選擇人肺泡上皮細胞作為研究對象，探討二甲雙胍對急性肺損傷細胞凋亡、遷移和EMT的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2022年6—11月。

1.2 主要材料、試劑及儀器 人肺泡上皮細胞（A549細胞）購自中國科學院細胞庫。二甲雙胍、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）（上海碧云天生物技術有限公司，純度≥98%），p38 MAPK信號通路抑制劑——SB203580、p38 MAPK信號通路激活劑——C16-PAF（上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%），胎牛血清（美國Gibco公司），F-12K培養基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）、RIPA裂解液、CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），Hoechst 33258染色液（上海愛必信生物科技有限公司），鼠抗人抗體〔E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白（fibronectin，FN）、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK、β-actin一抗〕、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（二抗）（英國Abcam公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。MCO18AIC型CO2培養箱（日本三洋電機公司），MF52-N型倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電技術有限公司），IMARK型酶標儀（美國BIORAD公司），FluorChem HD2型凝膠成像系統（美國Proteinsimple公司）。

1.3 細胞培養 取液氮中凍存的A549細胞進行復蘇，將其置于F-12K培養基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養，待細胞貼壁達80%以上時進行細胞傳代，取第3代對數生長期細胞進行后續實驗。

1.4 分組及給藥 將A549細胞分為對照組、H2O2組、2.5 mmol/L二甲雙胍組、5.0 mmol/L二甲雙胍組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組，對照組不做任何干預；H2O2組加入400 μmol/L H2O2作用24 h，以構建體外急性肺損傷細胞模型；2.5 mmol/L二甲雙胍組、5.0 mmol/L二甲雙胍組、10.0 mmol/L二甲雙胍組在H2O2組基礎上分別加入2.5、5.0、10.0 mmol/L二甲雙胍進行干預；SB203580組在H2O2組基礎上加入10.0 mmol/L SB203580進行干預，選取細胞活力最佳時的藥物濃度進行后續實驗。

將A549細胞分為對照組、H2O2組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組、抑制劑組和激活劑組，對照組、H2O2組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組干預方法同前，抑制劑組和激活劑組在10.0 mmol/L二甲雙胍組基礎上分別加入10 μmol/L SB203580和10 μmol/L C16-PAF。在37 ℃、5% CO2條件下培養，每組設置3個復孔。

1.5 CCK-8法測定細胞活力 取對照組、H2O2組、2.5 mmol/L二甲雙胍組、5.0 mmol/L二甲雙胍組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組A549細胞，調整密度為2×105個/ml，將其接種至96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μl。各組干預24 h后，加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，使用酶標儀測定各組OD值（450 nm處），計算細胞活力，細胞活力（%）=（目標組OD值-空白組OD值）/空白組OD值×100%。實驗獨立重復3次。

1.6 Hoechst 33258染色法測定細胞凋亡率 取對照組、H2O2組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組、抑制劑組、激活劑組A549細胞，用PBS洗滌2次、5 min/次，加入4%多聚甲醛溶液，于4 ℃環境下固定10 min；用PBS洗滌3次，加入5 mg/L Hoechst 33258染色液染色10 min；用PBS洗滌3次，封固后在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。細胞凋亡特征為細胞核體積濃縮變小，染色不均，濃染且所發熒光較強，呈亮藍色。計算細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100%。實驗獨立重復3次。

1.7 劃痕試驗測定細胞遷移率 取對照組、H2O2組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組、抑制劑組、激活劑組A549細胞，將細胞接種于6孔板，密度達到90%時，采用200 μl移液器槍頭進行劃痕試驗，在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。采用倒置熒光顯微鏡拍照記錄0 h和24 h劃痕情況，計算劃痕面積并將其分別記為S0h和S24h，計算細胞遷移率，細胞遷移率=（S0h-S24h）/S0h×100%。實驗獨立重復3次。

1.8 RT-qPCR法測定EMT相關因子mRNA相對表達量取對照組、H2O2組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組、抑制劑組、激活劑組A549細胞，采用RNA抽提試劑盒提取細胞樣本總RNA，采用NanoDrop檢測RNA的濃度及純度，并將其反轉錄合成模板鏈cDNA，取2 μl反轉錄產物進行PCR（引物序列：GAPDH上游引物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；E-鈣黏蛋白上游引物為5'-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3'，下游引物為5'-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3'；N-鈣黏蛋白上游引物為5'-A G A G G A A G A C C A G G A C T A T G A C T T G A G-3'，下游引物為5'-TACTGTGGCTCAGCGTGGATAGG-3'；波形蛋白上游引物為5'-GCGTGACGTACGTCAGCAATATGA-3'，下游引物為5'-GTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTT-3'；FN上游引物為5'-TGGAGGAAGCCGAGGTTT-3'，下游引物為5'-CAGCGGTTTGCGATGGTA-3'），以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的mRNA相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.9 Western blot法測定EMT相關因子蛋白及p38 MAPK信號通路相關蛋白相對表達量 取對照組、H2O2組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組、抑制劑組、激活劑組A549細胞，提取蛋白并進行定量后上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封閉2 h后參照抗體說明書加入按照一定比例稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗滌后加入山羊抗鼠IgG二抗，孵育2 h，洗滌3次，最后加入顯影液，使用凝膠成像系統拍照記錄。蛋白灰度值用G表示，計算蛋白相對表達量，蛋白相對表達量=G目的蛋白/Gβ-actin。實驗獨立重復3次。

1.10 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞活力 干預24 h后，對照組細胞活力為（0.967±0.098），H2O2組為（0.423±0.063），2.5 mmol/L二甲雙胍組為（0.500±0.062），5.0 mmol/L二甲雙胍組為（0.746±0.086），10.0 mmol/L二甲雙胍組為（0.826±0.097），SB203580組為（0.856±0.090）。六組細胞活力比較，差異有統計學意義（F=19.386，P＜0.001）；其中H2O2組細胞活力低于對照組，5.0 mmol/L二甲雙胍組、10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組細胞活力高于H2O2組，10.0 mmol/L二甲雙胍組細胞活力高于5.0 mmol/L二甲雙胍組，差異有統計學意義（P＜0.05）。本研究選取細胞活力最佳時的藥物濃度（10.0 mmol/L二甲雙胍）進行后續實驗。

2.2 細胞凋亡率、細胞遷移率 六組細胞凋亡率、細胞遷移率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中H2O2組細胞凋亡率、細胞遷移率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組細胞凋亡率、細胞遷移率低于H2O2組，差異有統計學意義（P＜0.05）；抑制劑組細胞凋亡率、細胞遷移率低于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，差異有統計學意義（P＜0.05）；激活劑組細胞凋亡率、細胞遷移率高于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1～2。

圖1 六組細胞凋亡情況（Hoechst 33258染色，×20）Figure 1 Cell apoptosis in six groups

圖2 六組細胞遷移情況Figure 2 Cell migration of the six groups

表1 六組細胞凋亡率、細胞遷移率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of apoptosis rate and cell migration rate among the six groups

表1 六組細胞凋亡率、細胞遷移率比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of apoptosis rate and cell migration rate among the six groups

注：H2O2=過氧化氫；a表示與對照組比較，P ＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05；c表示與10.0 mmol/L二甲雙胍組比較，P＜0.05；d表示與SB203580組比較，P＜0.05

組別 細胞凋亡率 細胞遷移率對照組 5.00±1.00 5.06±0.52 H2O2組 60.00±6.35a 50.36±6.54a 10.0 mmol/L二甲雙胍組 33.67±3.42b 20.83±2.78b SB203580組 33.33±3.51b 20.14±2.23b抑制劑組 9.00±1.73cd 3.22±0.33cd激活劑組 54.33±6.21cd 34.51±4.39cd F值 85.654 76.906 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 EMT相關因子mRNA和蛋白相對表達量 六組E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中H2O2組E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量低于對照組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量高于H2O2組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量低于H2O2組，差異有統計學意義（P＜0.05）；抑制劑組E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量高于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量低于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，差異有統計學意義（P＜0.05）；激活劑組E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量低于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量高于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2、圖3。

圖3 六組EMT相關因子蛋白表達SDS-PAGE圖Figure 3 SDS-PAGE of protein expression of EMT-related factors in the six groups

表2 六組EMT相關因子mRNA和蛋白相對表達量比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA and protein relative expression of EMT-related factors among the six groups

表2 六組EMT相關因子mRNA和蛋白相對表達量比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA and protein relative expression of EMT-related factors among the six groups

注：FN=纖維連接蛋白；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05；c表示與10.0 mmol/L二甲雙胍組比較，P＜0.05；d表示與SB203580組比較，P＜0.05

組別E-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白 波形蛋白 FN mRNA相對表達量 蛋白相對表達量 mRNA相對表達量 蛋白相對表達量 mRNA相對表達量 蛋白相對表達量 mRNA相對表達量 蛋白相對表達量對照組 1.01±0.10 0.85±0.09 0.43±0.05 0.39±0.04 0.64±0.07 0.65±0.07 0.57±0.06 0.59±0.06 H2O2組 0.58±0.06a 0.50±0.07a 0.66±0.07a 0.51±0.06a 0.89±0.09a 0.87±0.07a 0.95±0.10a 0.89±0.09a 10.0 mmol/L二甲雙胍組 0.71±0.08b 0.69±0.07b 0.49±0.06b 0.37±0.03b 0.76±0.08b 0.79±0.08b 0.76±0.08b 0.26±0.03b SB203580組 0.71±0.08b 0.63±0.07b 0.49±0.04b 0.23±0.03b 0.75±0.09b 0.73±0.08b 0.76±0.09b 0.26±0.02b抑制劑組 0.91±0.07cd 1.04±0.11cd 0.26±0.02cd 0.20±0.02cd 0.61±0.07cd 0.56±0.06cd 0.56±0.06cd 0.11±0.01cd激活劑組 0.39±0.04cd 0.30±0.04cd 0.60±0.07cd 0.51±0.06cd 0.88±0.09cd 0.89±0.09cd 0.94±0.08cd 0.77±0.08cd F值 27.233 33.247 19.606 28.827 6.058 8.615 13.657 91.938 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.005 0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 p38 MAPK信號通路相關蛋白相對表達量 六組p38 MAPK相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。六組磷酸化p38 MAPK相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中H2O2組磷酸化p38 MAPK相對表達量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組磷酸化p38 MAPK相對表達量低于H2O2組，差異有統計學意義（P＜0.05）；抑制劑組磷酸化p38 MAPK相對表達量低于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，差異有統計學意義（P＜0.05）；激活劑組磷酸化p38 MAPK相對表達量高于10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖4。

圖4 六組p38 MAPK信號通路相關蛋白表達SDS-PAGE圖Figure 4 SDS-PAGE of protein expression of p38 MAPK signaling pathway-related in the six groups

表3 六組p38 MAPK信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression of p38 MAPK signaling pathway-related among the six groups

表3 六組p38 MAPK信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of protein relative expression of p38 MAPK signaling pathway-related among the six groups

注：p38 MAPK=p38絲裂原活化蛋白激酶；a表示與對照組比較，P＜0.05；b表示與H2O2組比較，P＜0.05；c表示與10.0 mmol/L二甲雙胍組比較，P＜0.05；d表示與SB203580組比較，P＜0.05

組別 p38 MAPK 磷酸化p38 MAPK對照組 0.37±0.04 0.35±0.04 H2O2組 0.38±0.04 0.64±0.07a 10.0 mmol/L二甲雙胍組 0.40±0.05 0.27±0.03b SB203580組 0.40±0.05 0.26±0.03b抑制劑組 0.38±0.04 0.13±0.02cd激活劑組 0.40±0.05 0.49±0.05cd F值 0.259 53.464 P值 0.927 ＜0.001

3 討論

急性肺損傷的發病機制較為復雜且尚未完全明確，屬于臨床常見的危重癥。急性肺損傷能夠造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，促使機體出現急性低氧性呼吸功能不全，對患者生命造成嚴重威脅［9］。目前臨床上仍以機械通氣為基礎對癥治療急性肺損傷，但患者病死率較高［10］。因此，探究能夠有效抑制急性肺損傷發生及發展的藥物意義重大。二甲雙胍為雙胍類口服降糖藥，在臨床上已經應用多年［11］，近年來研究發現，二甲雙胍除了具有降糖作用外，還能發揮抗炎作用以及減少氧化應激損傷［12］。據報道，二甲雙胍能夠對內毒素誘導的急性肺損傷發揮抗炎作用［13］。盛琦等［14］研究顯示，二甲雙胍對H2O2誘導的細胞損傷具有保護作用。另有研究表明，二甲雙胍能夠減輕脂多糖誘導的急性肺損傷［15］，但二甲雙胍對H2O2誘導的急性肺損傷的作用未見報道。本研究結果顯示，H2O2組細胞活力低于對照組，提示H2O2可以誘導A549細胞氧化損傷，降低細胞活力。加入二甲雙胍處理后，5.0 mmol/L二甲雙胍組、10.0 mmol/L二甲雙胍組和SB203580組細胞活力高于H2O2組，說明5.0、10.0 mmol/L二甲雙胍和SB203580可以減輕H2O2誘導的氧化損傷，提高細胞活力。本研究選取干預細胞活力的最佳藥物濃度（10.0 mmol/L二甲雙胍）進行后續實驗，結果顯示，H2O2組細胞凋亡率、細胞遷移率高于對照組，說明H2O2可促進人肺泡上皮細胞凋亡和細胞遷移；加入10.0 mmol/L二甲雙胍和SB203580后，細胞凋亡率、細胞遷移率降低，說明10.0 mmol/L二甲雙胍和SB203580均可以抑制H2O2誘導的細胞凋亡和細胞遷移，這與熊存全等［16］研究報道相符。EMT典型特征是在一系列生物學過程中獲得具有遷移性與侵襲性間充質表型，其進程與細胞侵襲、遷移能力關系密切，E-鈣黏蛋白和N-鈣黏蛋白是EMT進程中極為重要的調控因子［17-18］。本研究結果顯示，與對照組比較，H2O2組E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量降低，N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量升高，10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量高于H2O2組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量低于H2O2組，提示10.0 mmol/L二甲雙胍和SB203580可抑制H2O2誘導的急性肺損傷EMT。

p38 MAPK信號通路在炎癥和應激反應中發揮著重要作用，其可誘導炎癥及細胞凋亡［19］。近年來研究表明，p38 MAPK信號通路與急性肺損傷關系密切［20］。陳昱曉等［21］研究顯示，急性肺損傷小鼠體內存在p38 MAPK信號通路相關蛋白過度激活情況，而阻斷該信號通路則能夠減輕肺損傷。王貴佐等［22］研究顯示，二甲雙胍可對脂多糖誘導的急性肺損傷發揮保護作用。武麗濤等［23］研究表明，二甲雙胍可能通過抑制p38 MAPK信號通路來發揮抗炎作用。另有研究表明，黃芩苷能夠通過抑制p38 MAPK信號通路而有效減輕脂多糖所致的急性肺損傷［24］。既往關于二甲雙胍對脂多糖誘導的急性肺損傷影響的研究較多，但關于二甲雙胍在H2O2誘導A549細胞發生急性肺損傷過程中對p38 MAPK信號通路的調控作用未見報道，本研究結果顯示，H2O2組磷酸化p38 MAPK相對表達量高于對照組，10.0 mmol/L二甲雙胍組、SB203580組磷酸化p38 MAPK相對表達量低于H2O2組，提示二甲雙胍和SB203580可能抑制了p38 MAPK信號通路的激活。本研究在10.0 mmol/L二甲雙胍組基礎上分別加入SB203580和C16-PAF發現，與10.0 mmol/L二甲雙胍組比較，抑制劑組細胞凋亡率、細胞遷移率、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN mRNA和蛋白相對表達量、磷酸化p38 MAPK相對表達量降低，E-鈣黏蛋白mRNA和蛋白相對表達量升高，激活劑組則與抑制劑組結果相反，提示二甲雙胍可能通過抑制p38 MAPK信號通路激活而抑制H2O2誘導的細胞凋亡、遷移及EMT。

綜上所述，二甲雙胍可能通過抑制p38 MAPK信號通路激活而抑制H2O2誘導的急性肺損傷人肺泡上皮細胞凋亡、遷移及EMT。下一步需在動物模型中探究二甲雙胍對H2O2誘導的急性肺損傷的作用機制，為阻斷急性肺損傷的相關研究提供更為全面的理論參考。

作者貢獻：歐陽運萍進行文章的構思與設計，論文的修訂；陳濤進行研究的實施與可行性分析；李鵬進行資料收集；歐陽運萍、陳濤負責論文撰寫；趙博進行統計學處理；楊小軍進行資料整理，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。