洋甘菊中2種咖啡酰基奎寧酸大孔樹脂純化工藝的優化

張柏生 ，熱依木古麗·阿布都拉，信學雷，范芳芳 ，李 茜

（1. 新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆中藥炮制研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830000；3. 中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室，新疆特有藥用資源利用省部共建國家重點實驗室培育基地，中國科學院新疆理化技術研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

洋甘菊（Matricarla chamomillaL.）的藥用歷史悠久。新疆民族藥中的多個處方含洋甘菊，《中華人民共和國衛生部藥品質量標準》（維吾爾藥分冊）中就收錄了3個包含洋甘菊的制劑。洋甘菊具有抗菌、抗炎、解痙、抗潰瘍、增強免疫力、降低血脂、降低血糖等作用，主要用于治療感冒、咳嗽，中風等癥[1-2]。國內外的大量研究表明洋甘菊中含黃酮類、酚酸類、香豆素類、萜類、揮發油、多糖類及其他化學成分[3-6]。這些成分是洋甘菊藥理作用的物質基礎。其中咖啡酰基奎寧酸類已被證實具有抗炎、抗哮喘、抗腫瘤、抗類風濕性關節炎等作用[7-8]。在前期提取工藝研究基礎上，本研究以3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸的含量為指標，考察具有不同物理結構和化學結構（不同極性）的10種樹脂的靜態吸附-解吸能力，篩選出純化功能最好的樹脂型號AB-8。進一步研究AB-8型大孔吸附樹脂富集洋甘菊活性部位過程中吸附量、上樣量、上樣濃度、解吸參數等因素的影響，使工藝更加適應工業化生產。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型超高效液相色譜系統，包括Waters 2489 UV/Visible Detector，Empower色譜工作站（美國Waters公司）；UV-2550型紫外可見分光光度儀（日本島津）；R-210型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi）；FDU-2100型冷凍干燥器（日本EYELA）；DZF-6050B型真空干燥箱（上海齊欣）；MOOEL ESJ-6020型電子分析天平（沈陽龍騰）。

1.2 試藥

HPD-100，HPD-450，HPD-600，HPD-750型大孔吸附樹脂（滄州寶恩）；D101型大孔吸附樹脂（上海摩速）；D140，D4020，AB-8，NKA-9，X-5型大孔吸附樹脂（南開大學化工廠）；3, 4-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品，4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品（中國科學院新疆理化技術研究所自制）；乙腈，甲醇為色譜純（美國Fisher公司）；超純水。

1.3 藥材

洋甘菊藥材購自新疆伊犁地區昭蘇縣，為《國家藥品標準維吾爾藥分冊》收載，經新疆維吾爾自治區中醫醫院李玲主任藥師鑒定為菊科母菊屬一年生或多年生草本植物，拉丁名Matricarla chamomillaL.[9]。

2 方法與結果

2.1 洋甘菊活性部位的制備

取洋甘菊全草4 kg，加70 %乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比1:30，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，加水稀釋至0.20 g/ml。

2.2 咖啡酰奎寧酸含量測定方法學研究

2.2.1 色譜條件 Thermo Golden Proshell C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；以0.2 %甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，程序見表1。330 nm下采集指標成分的峰面積；柱溫設置為35 ℃，流速設置為0.3 ml/min。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品適量，置于50 ml量瓶中，加60 %甲醇超聲溶解，定容，搖勻，制成對照品溶液，每1 ml溶液中含3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸分別為43.3 μg/ml和33.5 μg/ml。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取樣品粉末（過40目篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，精密加入60 %乙醇100 ml，稱定重量，浸泡30 min后加熱回流40 min，取出，放冷，用60 %乙醇補足重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 測定法 按2.2.1項色譜條件，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μl，注入超高效液相色譜儀，測定峰面積，用外標一點法計算供試品中兩種咖啡酰奎寧酸的含量。

2.2.5 線性關系考察 精密量取3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品溶液1，2，3，4，5，6，7 ml于10 ml量瓶中，加60 %甲醇至刻度，搖勻，即得。按2.2.1項下條件測定，進樣量10 μl。以對照品峰面積（Y）對其濃度（X，μg/ml）進行線性回歸。分別得到3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸標準曲線，見表2。

表2 線性回歸方程

2.2.6 精密度試驗 精密量取3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品溶液適量，置于10 ml量瓶中，加60 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1項色譜條件進樣測定，連續進樣6次，計算得3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸峰面積的RSD分別為0.048 %和0.088 %，表明方法精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密稱取供試品粉末適量，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件，在0，2，4，8，12，24 h進樣測定，計算得3,5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸峰面積RSD值分別為1.23 %和0.68 %, 表明供試品溶液室溫下24 h內穩定。

2.2.8 重復性試驗 精密稱取供試品粉末適量，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.2.1項下色譜條件下測定，測得供試品中3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸的平均含量分別為0.173 %和0.12%，RSD值分別為0.44 %和0.46 %，表明方法的重復性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 取同批次已知含量（3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸含量分別為0.173 %，0.12 %）的藥材70 mg，精密稱定，共6份，置10 ml量瓶中，按樣品中咖啡酰奎寧酸含量1:1比例，精密加入兩種咖啡酰奎寧酸對照品，按2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下方法進樣測定，3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸的平均加樣回收率分別為96.90 %和99.89 %，RSD分別為0.83 %和2.26 %，結果見表3、表4。表明該分析方法準確。

表3 3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸加樣回收試驗結果

表4 4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸加樣回收試驗結果

2.3 樹脂處理

用95 %乙醇浸泡10種大孔樹脂2～4 h，排出乙醇后，用蒸餾水反復沖洗至樹脂在試管中不顯渾濁為止，再用超純水充分淋洗樹脂至無醇味，抽濾。

2.4 大孔吸附樹脂吸附率和解吸率的計算方法

按下式計算樹脂吸附率和解吸率。

A0為原液中指標成分的峰面積；A流為流出液中指標成分的峰面積；A解為解吸液中指標成分的峰面積。

2.5 樹脂的篩選

稱取10種已處理好的大孔吸附樹脂各2 g，加洋甘菊提取液30 ml，置于搖床，25 ℃、87 r/min振搖2 h，放置10 h，抽濾，測定指標成分的峰面積。濾去提取液后的大孔樹脂水洗抽干，加70 %乙醇30 ml，25 ℃、87 r/min振搖2 h，放置2 h，進行靜態解吸，測定解吸液指標成分的峰面積，計算吸附率和解吸率，結果見表5。

表5 10種大孔樹脂靜態吸附-解吸情況

由表3可見，綜合考慮各樹脂的吸附率和解吸率，選擇AB-8進行后續試驗。

2.6 上樣濃度的考察

將AB-8樹脂按2.3項下方法處理，裝入樹脂床體積（BV）為50 ml的樹脂柱，分別加入生藥濃度為0.20，0.16，0.12 g/ml的上樣液10 BV，吸附流速為2 BV/h, 收集每1 BV（50 ml）流出液，離心，過濾，進行超高效液相色譜（UPLC）測定，計算吸附率，確定上樣濃度。結果見表6。

表6 上樣濃度考察結果

由表6可見， 隨著上樣濃度的降低，吸附量在持續增加。上樣濃度為0.16，0.12 g/ml時，10倍上樣體積時還未達到吸附飽和。上樣液濃度為0.2 g/ml時，與其他上樣濃度（0.16，0.12 g/ml）相比，上樣時間短，且上樣液總體積較小，考慮到實際生產需要，選擇上樣濃度為0.20 g/ml。

2.7 上樣量的考察

根據上樣濃度考察結果，選擇吸附量為90 %以上的上樣體積作為最終上樣量。即，對于生藥濃度為0.20 g/ml的提取液，最佳上樣量為7 BV（見表6）。

2.8 吸附速率的考察

量取洋甘菊提取液（0.20 g/ml）400 ml，經50 ml（徑高比為1:6）AB-8型大孔吸附樹脂柱吸附，流速分別設計為 1，2，3 BV/h ，收集流出液，測定指標成分的峰面積，計算吸附率。結果見表7。

表7 洋甘菊提取液吸附速率的考察結果

由表7可見，當吸附速率成倍增加時，3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸的吸附量反而下降。當吸附速率為 3 BV/h時，吸附量顯著減少。考慮到產業化生產需要，選擇吸附速率為2 BV/h。

2.9 水沖洗用量的考察

將吸附飽和的樹脂柱按5 BV/h流速，用純凈水洗脫樹脂未吸附的溶液，收集流出液，測定目標成分的峰面積。結果表明，結合生產需要，用水量為1 BV最合適，見表8。

表8 水洗量的考察結果

2.10 洗脫溶劑的考察

分別量取洋甘菊提取液（生藥濃度為0.2 g/ml）350 ml，以2 BV/h吸附速率，經50 ml（徑高比1:6）AB-8樹脂柱吸附，再以5 BV/h流速，用1 BV水洗后，分別用 50 %，70 %，95 %乙醇溶液洗脫目標化合物, 收集洗脫液4 BV，測定指標成分的峰面積，計算解吸率，結果見表9。

表9 洗脫溶劑的考察結果

由表9可見，幾種溶劑對目標化合物的洗脫效果無明顯差別。需進一步綜合考察洗脫劑和用量。

2.11 洗脫溶劑和用量的考察

取洋甘菊提取液（生藥濃度為0.2 g/ml）350 ml，以2 BV/h吸附速度，經50 ml（徑高比1:6）AB-8樹脂柱吸附，再以 5 BV/h流速，用1 BV水洗后，依次用50 %乙醇3 BV、70 %乙醇3 BV、95 %乙醇3 BV洗脫目標化合物，測定峰面積，計算解吸率。結果見表10。

表10 洗脫溶劑的考察結果

由表10可見，用3 BV 50 %乙醇洗脫之后，1 BV 70 %乙醇基本上可把目標化合物洗脫出來。

3 討論

本文以3, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸和4, 5-二-O-咖啡酰基奎寧酸兩種特征成分為洋甘菊活性部位含量測定指標，對10種不同型號和功能的大孔吸附樹脂進行靜態吸附和解吸功能評價，選出適合洋甘菊活性部位富集功能的樹脂型號AB-8。進一步對洋甘菊提取物純化效率的影響因素（上樣量、上樣濃度、吸附速率、洗脫溶劑和用量等）進行考察。最終確定洋甘菊活性部位制備工藝：采用AB-8型大孔吸附樹脂，藥液濃度0.20 g/ml（相當于原生藥），樹脂柱徑高比1:6，吸附速率2 BV/h，在此條件下，上柱量達到7 BV；吸附好的樹脂先以5 BV/h流速的1 BV水洗凈，再依次用3 BV 50 %乙醇和1 BV 70 %乙醇洗脫，合并洗脫液，濃縮，干燥。

咖啡酰基類衍生物種類繁多，具有抗炎、抗氧化、抗菌等廣泛的生物活性，同時具有低毒、抗耐藥、易制備等優點[10]。因此選擇二咖啡酸奎寧酸化合物為提取工藝考察指標。

前期研究證明洋甘菊活性成分主要集中在中等偏大極性部位，同時考慮到大工業生產的需要，考慮直接使用50 %乙醇進行洗脫。50 %乙醇主要洗脫成分為酚酸類物質[11-13]。但活性部位的目標成分不止酚酸類物質，還有生物活性較好的黃酮類物質。同時有文獻報道黃酮類物質一般需用70 %乙醇才能將其從大孔樹脂上洗脫下來，最終確定采用3 BV 50 %乙醇洗脫后用1 BV 70 %乙醇繼續洗脫，得目標活性部位[14-15]。該純化工藝具有吸附量大、吸附速度快、易于解吸附、成分損失少、樹脂使用周期長等優點，適合大規模工業化生產。