HPLC測定D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽中的手性異構(gòu)體

許 鑫，劉 蕊，孔令蘭，王艷梅

（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272100）

β-內(nèi)酰胺抗生素抗菌效力好，毒副作用低，應(yīng)用廣泛。氨芐西林是β-內(nèi)酰胺類的一類代表性藥物，主要用于治療細(xì)菌感染，如中耳炎、鼻竇炎及急性細(xì)菌性膀胱炎等。D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽是一類重要的醫(yī)藥起始物料及中間體，是酶法生產(chǎn)氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢克洛等β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物不可或缺的活性側(cè)鏈[1]。D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽的手性異構(gòu)體參與反應(yīng)，易造成后續(xù)氨芐西林中手性雜質(zhì)的生成。目前對其手性異構(gòu)體的拆分研究鮮有報(bào)道，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-8]，建立手性固定相高效液相色譜（HPLC）測定D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽中手性異構(gòu)體L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽含量的方法。該方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，適用于D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽手性雜質(zhì)的控制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；MSA6.6S-OCE-DM電子天平（德國Sartorius）；XSR205DU/A型電子天平（Mettler Toledo）。

1.2 藥品與試劑

D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽樣品（河北澤碩藥業(yè)科技有限公司，批號：2104003，2104004，2104005）；L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽對照品（河源廣譜生物科技有限公司，批號：G31210128-01，含量：97.75 %）；正己烷（色譜級，天津賽福瑞科技有限公司）；二乙胺（色譜級，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；異丙醇（色譜級，美國Fisher）；無水乙醇（色譜級，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CHIRALPAK IA（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；流動(dòng)相：正己烷:異丙醇:二乙胺（920:80:1）；柱溫30 ℃；流速0.8 ml/min；進(jìn)樣體積：20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽對照品約5 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取對照品儲(chǔ)備溶液1 ml，置20 ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 混合溶液（加標(biāo)供試品溶液） 取D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽約50 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，精密吸取L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽對照品儲(chǔ)備溶液1 ml，置同一20 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽約50 mg，精密稱定，置20 ml量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 測定方法

分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合溶液、對照品溶液、供試品溶液各20 μl，進(jìn)樣檢測，混合溶液中L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽的分離度應(yīng)不得低于1.5，供試品溶液色譜圖中如有L-苯甘氨酸甲酯峰，按外標(biāo)法計(jì)算其含量。

2.4 分析條件的優(yōu)化

通過對檢測波長、流動(dòng)相比例、色譜柱等進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳色譜條件。

2.4.1 檢測波長的選擇 通過儀器全波長掃描，D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽樣品在230 nm有較強(qiáng)吸收，因此選擇230 nm作為檢測波長。

2.4.2 流動(dòng)相選擇 在方法摸索過程中，以正己烷:異丙醇=90:10、正己烷:異丙醇=95:5、正己烷:異丙醇=92:8為流動(dòng)相，均無法將L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽拆分；結(jié)合正己烷與異丙醇不同比例組合中L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽保留時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果，最終選擇以正己烷:異丙醇=92:8為流動(dòng)相，在流動(dòng)相中加入二乙胺，含量為0.1 %，L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽在該流動(dòng)相中得到了很好的分離。

2.4.3 色譜柱選擇 在方法摸索過程中，對比了L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽在CHIRALPAK AD-H、CHIRALPAK IA與CHIRALPAK IC色譜柱中的分離情況及峰形。結(jié)果表明，L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽在CHIRALPAK AD-H色譜柱中無法分離，在CHIRALPAK IC色譜柱中未能完全分離且峰嚴(yán)重拖尾，峰型較差；但在CHIRALPAK IA色譜柱中兩者分離度符合規(guī)定，峰形良好。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 取空白溶劑（無水乙醇）、對照品溶液、混合溶液各20 μl，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，空白溶劑（無水乙醇）對L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽檢測無干擾；混合溶液中，L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽的分離度＞1.5，符合規(guī)定。專屬性疊加圖見圖1。

圖1 專屬性疊加圖

2.5.2 檢測限與定量限 將2.2.1項(xiàng)下L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽對照品溶液以無水乙醇為溶劑進(jìn)行稀釋，測出的信號與空白處的信號（基線噪音）進(jìn)行比較。對照品溶液濃度稀釋為1.3 μg/ml時(shí)，L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與空白溶劑信噪比（S/N）略大于10，此濃度即為定量限；對照品溶液濃度稀釋為0.6 μg/ml時(shí)，S/N略大于3，此濃度即為檢測限。

2.5.3 線性 分別精密吸取對照品儲(chǔ)備溶液，加無水乙醇稀釋制成1.3～37.6 μg/ml溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。以濃度（x）對峰面積（y）作線性回歸，回歸方程為：y=0.119x-0.046，相關(guān)系數(shù)（r）為0.998。

2.5.4 重復(fù)性與中間精密度 兩位分析員，在不同日期，分別配置制加標(biāo)供試品溶液6份，采用不同儀器，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果，兩位分析員分別配置的6份加標(biāo)供試品溶液測定重復(fù)性RSD分別為2.4 %和4.1 %，不同分析員12次測定中間精密度的RSD為4.4 %，均小于5 %。

2.5.5 準(zhǔn)確度 取L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽對照品約5 mg，加無水乙醇溶解并定量稀釋制成約0.5 mg/ml的溶液作為雜質(zhì)對照品儲(chǔ)備液。分別取D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽約50 mg，精密稱定，分置于9個(gè)20 ml量瓶中，分成3組，分別加入對照品儲(chǔ)備溶液0.8，1.0，1.2 ml，加無水乙醇稀釋定容刻度，制成80 %，100 %，120 % 3個(gè)濃度的準(zhǔn)確度試驗(yàn)溶液。分別精密量取上述溶液各20 μl，進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，平均回收率為104.3 %，RSD＜10.0 %。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 耐用性 分別改變流速±0.1 ml/min、流動(dòng)相中異丙醇比例±5 %、二乙胺添加量±20 %，評價(jià)流速、流動(dòng)相配比、二乙胺添加量改變后對檢測的影響。結(jié)果表明，色譜條件略有變動(dòng)時(shí)，檢測結(jié)果與原條件檢測結(jié)果的相對偏差（RD）均小于5 %，符合規(guī)定，表明方法耐用性良好。

2.6 樣品測定 取D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽樣品，對其L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。3批樣品中L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽含量均低于0.05 %。

表2 D-苯甘氨酸甲酯鹽酸供試品中L-苯甘氨酸甲酯鹽酸含量檢測結(jié)果

3 討論

本文嘗試以不同比例的正己烷與異丙醇組合為流動(dòng)相，均不能將L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽拆分。向正己烷:異丙醇（92:8）混合液中添加0.1 %二乙胺后，兩者分離良好。同時(shí)也對色譜柱進(jìn)行了篩選，選用CHIRALPAK IA（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱時(shí)，L-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽與D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽不僅分離度符合規(guī)定，且峰形良好。該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度良好，可為D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽中手性異構(gòu)體的檢測提供重要依據(jù)。