西格列汀通過降低腦內炎性因子水平改善糖尿病小鼠學習記憶能力

韓麗男，周 游，陳 旭，李佳男

（哈爾濱商業大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

根據國際糖尿病聯盟（The International Diabetes Federation，IDF）2021全球糖尿病地圖（第10版）最新數據顯示，2021年全世界有5.37億糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者；到2030年，DM患者預計會達到6.43億；到2045年將上升到7.83億[1]，成為繼心血管疾病和惡性腫瘤后的第三大世界公共衛生問題[2]。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是較常見的一種DM類型，占DM總數的95 %以上[3]。T2DM患者的典型特征為高血糖，持續的高血糖狀態會引起機體炎癥反應，其中神經炎癥可損壞腦功能的完整性，導致認知功能下降[4]。腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白介素6（interleukin，IL-6）、IL-1β等在神經炎癥中發揮著重要作用[5]。

二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP-4）抑制劑是口服治療DM藥物，以葡萄糖依賴的方式進行血糖調節[6]。本研究采用高糖高脂飲食聯合小劑量（80 mg/kg）STZ建立T2DM小鼠模型，探討DPP-4抑制劑磷酸西格列汀對T2DM小鼠的學習記憶能力的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ZZ-611800自主活動儀（成都泰盟科技有限公司）；WMT-100Morris分析系統（成都泰盟軟件有限公司）；TDL-60B低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；RT-6000酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

1.2 試藥

磷酸西格列汀片（杭州默沙東制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；GSP、TC、TG、LDL-C、HDL-C測試盒（南京建成生物工程研究所）；INS、C-P、IL-6、TNF-α、IL-1β試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）。

1.3 動物

SPF級健康雄性ICR小鼠45只，體重（20±2）g（長春市億斯實驗動物技術有限責任公司），實驗動物許可證號：SCXK（吉）-2020-0002。符合國家實驗室動物倫理保護標準及相關法律規定。實驗期間動物自由采食飲水。

2 方法

2.1 模型制備、動物分組及給藥

所有小鼠適應性喂養1 w后，按體重隨機抽取15只小鼠作為空白對照組，其余小鼠高脂飼料喂養4 w后，禁食不禁水14 h，腹腔注射STZ檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（80 mg/kg），空白組小鼠注射等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2 w后尾靜脈采血測定小鼠的空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），并以FBG＞11.1 mmol/L視為模型復制成功的標準。

將模型復制成功的小鼠分為模型組、西格列汀組。西格列汀組動物灌胃給藥16.32 mg/(kg·d)，模型組和正常對照組每天灌胃等體積純凈水，連續灌胃56 d。

2.2 體質量及空腹血糖的測定

分別于給藥的0，2，4，6，8 w測量一次體質量及FBG。

2.3 自主活動、水迷宮、熱Y迷宮評價小鼠的活躍程度及學習記憶能力

分別于給藥2，4，6，8 w進行自主活動，將小鼠放入自主活動儀適應后，記錄5 min內小鼠的活動數及站立數。給藥第8 w進行水迷宮及熱Y迷宮實驗。Morris水迷宮記錄120 s內找到平臺的時間，即逃避潛伏期；熱Y迷宮每臂底部及交界處均鋪設電熱板，頂部裝有信號燈，開始實驗時，小鼠適應20 s后，隨機選擇一臂亮燈不通熱，其余兩臂不亮燈通熱（60～80 ℃），小鼠從起始臂進入，受到熱刺激后到達亮燈區停留5 s即為一次訓練，每只小鼠重復訓練直至達標（以連續20次訓練中≥18次正確為達標），最后記錄30次實驗內的錯誤次數。綜合以上3種方法評價小鼠的活躍程度及學習記憶能力。

2.4 樣本采集

所有小鼠禁食不禁水14 h，眼底靜脈叢取血，分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存。取血完畢后，剝離腦組織，-80 ℃冰箱中保存。進行HE染色的小鼠用1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，先用生理鹽水、后用多聚甲醛進行心臟灌流，分離小鼠腦組織于多聚甲醛溶液中保存。

2.5 指標檢測

2.5.1 血糖血脂相關指標檢測 取2.4項下凍存的血清，嚴格按試劑盒說明書測定C-P、FINS、GSP、TC、TG、HDL-C和LDL-C水平，按相應公式計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR），即HOMAIR=FBG×FINS/22.5。

2.5.2 腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定 取2.4項下凍存的腦組織，嚴格按照試劑盒說明書測定炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

2.5.3 HE染色觀察海馬神經元形態 取2.4項下保存的腦組織，乙醇梯度脫水，二甲苯脫臘，置于蘇木精-伊紅中進行染色，熒光顯微鏡下觀察海馬神經元的形態結構。

2.6 統計學分析

應用SPSS 26.0統計軟件分析數據，結果均以平均值±標準差（±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD。P＜0.05為差異有統計學意義，P＜0.01為差異有高度統計學意義。

3 結果

3.1 西格列汀對T2DM小鼠體質量的影響

與空白組比較，模型組體重顯著上升（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組比較，西格列汀組體質量有下降趨勢但差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥第4 w西格列汀組體質量下降，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果顯示西格列汀對T2DM小鼠體重有一定的改善作用。見圖1。

圖1 西格列汀對糖尿病小鼠體質量的影響

3.2 西格列汀對T2DM小鼠FBG的影響

與空白組比較，模型組FBG 顯著上升（P＜0.01），表明模型建立成功；與模型組比較，西格列汀組FBG顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）。結果顯示西格列汀對T2DM小鼠有顯著的降血糖作用。見圖2。

圖2 西格列汀對糖尿病小鼠FBG的影響

3.3 西格列汀對T2DM小鼠行為學的影響

與空白組相比，模型組自主活動活動數及站立數均低，第2，8 周與空白組差異有高度統計學意義（P＜0.01），表明糖尿病使小鼠行為活躍程度下降；西格列汀組與模型組相比，自主活動活動數及站立數均有所升高，第8周與模型組差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明西格列汀能改善T2DM小鼠精神萎靡的狀態。見表1、表2。

表1 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動活動數的影響（±s）

表1 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動活動數的影響（±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；#P＜0.05 vs 模型組

組別 n 小鼠自主活動活動數2 w 4 w 6 w 8 w空白組 12 10.25±4.18 6.67±5.23 4.27±3.10 6.25±1.91模型組 10 4.00±1.94** 4.10±2.26 4.10±2.39 2.90±1.37**西格列汀組10 8.50±0.50 5.70±3.58 6.80±4.04 6.00±3.22#

表2 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動站立數的影響（±s）

表2 西格列汀對糖尿病小鼠自主活動站立數的影響（±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；##P＜0.01 vs 模型組

組別 n 小鼠自主活動站立數2 w 4 w 6 w 8 w空白組 12 82.75±10.14 63.50±28.61 41.36±12.53 44.25±17.93模型組 10 56.44±19.00** 44.10±16.47 29.00±11.30* 21.50±9.80**西格列汀組10 74.75±15.40 46.70±32.47 44.80±25.77 45.20±20.70##

通過Morris水迷宮實驗發現，與空白組相比，模型組的逃避潛伏期有延長趨勢，第1次、第7次及第11次測試與空白組差異有統計學意義（P＜0.05），表明T2DM小鼠的空間學習記憶能力出現減退；西格列汀組與模型組相比，逃避潛伏期有縮短趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。與空白組比較，模型組測試期軌跡圖較復雜；與模型組比較，西格列汀組測試期軌跡清晰。見圖4。

圖3 西格列汀對糖尿病小鼠逃避潛伏期的影響

圖4 各組小鼠測試期定位航行軌跡圖

與空白組相比，模型組熱Y迷宮學習次數及錯誤次數顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，西格列汀組學習次數及錯誤次數顯著減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 西格列汀對糖尿病小鼠熱Y迷宮學習次數及錯誤次數的影響

Morris水迷宮和熱Y迷宮數據結果表明西格列汀能改善DM小鼠學習記憶能力。

3.4 西格列汀對T2DM小鼠糖代謝相關指標的影響

與空白組相比，模型組FINS、HOMA-IR、GSP水平及C-P水平顯著升高（P＜0.01），表明給予高糖高脂飼料聯合小劑量STZ誘導后的T2DM小鼠血糖維持著較高水平，胰島素水平升高，出現明顯的胰島素抵抗特征；與模型組相比，西格列汀組FINS、HOMA-IR、GSP水平及C-P水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），結果表明西格列汀對T2DM小鼠降糖效果較好，改善胰島素抵抗效果極佳。見表4。

表4 西格列汀對糖尿病小鼠糖代謝相關指標的影響（±s）

表4 西格列汀對糖尿病小鼠糖代謝相關指標的影響（±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；#P＜0.05 vs 模型組，##P＜0.01 vs 模型組

組別 n FINS/mIU·L-1 HOMA-IR GSP/mmol·L-1 C-P/ng·ml-1空白組 8 49.60±5.52 15.97±2.02 1.33±0.19 14.33±0.60模型組 8 83.30±5.35**64.88±34.33** 2.55±0.38** 19.38±0.56**西格列汀組8 65.84±5.72## 32.58±23.22# 1.63±0.43##1 7.16±1.98#

3.5 西格列汀對T2DM小鼠脂代謝相關指標的影響

與空白組相比，模型組TG、TC、LDL-C水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），而HDL-C水平顯著降低（P＜0.05），表明T2DM小鼠體內脂質代謝發生紊亂；與模型組相比，西格列汀組TG、TC水平顯著降低（P＜0.05），同樣LDL-C水平也降低但差異無統計學意義（P＞0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），說明西格列汀對T2DM小鼠脂質代謝紊亂有較好的調節作用。見圖5A、B、C、D。

圖5 西格列汀對糖尿病小鼠脂代謝相關指標的影響

3.6 西格列汀對T2DM小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響

與空白組相比，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，西格列汀組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著降低（P＜0.01）。西格列汀可顯著降低DM小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平。見表5。

表5 西格列汀對糖尿病小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響（ ±s）

表5 西格列汀對糖尿病小鼠腦組織炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響（ ±s）

注：**P＜0.01 vs 空白組；##P＜0.01 vs 模型組

組別 n TNF-α/pg·L-1 IL-6/pg·L-1 IL-1β/pg·L-1空白組 7 2.81±0.30 198.82±31.46 475.61±40.79模型組 7 5.37±0.21** 320.75±16.60** 611.33±64.13**西格列汀組7 3.44±1.10## 216.84±34.12##502.31±41.40##

3.7 西格列汀對T2DM小鼠海馬CA1、DG區的影響

空白組小鼠海馬CA1、齒狀回（dentate gyrus，DG）區細胞排列緊密，胞核清晰；模型組小鼠海馬CA1、DG區細胞排列松散；西格列汀組CA1、DG區細胞排列松散現象減輕。見圖6。

圖6 西格列汀對糖尿病小鼠海馬CA1、DG區的影響

4 討論

T2DM已經成為威脅人類生命健康的全球性問題，T2DM患者中60 %～70 %會伴有輕度認知障礙（mild cognitive impairment，MCI）[7]，嚴重者可發展為癡呆。目前T2DM并發MCI的機制尚未完全闡明，可能與非病理因素如高齡、文化程度低、吸煙[8]，病理因素如T2DM病程長、高血糖、炎癥反應、氧化應激、胰島素抵抗相關。近年炎癥因子在T2DM并發MCI機制探究中受到高度重視。

本實驗室前期采用高糖高脂飼料聯合不同劑量（80，90，100 mg/kg）的1%STZ進行T2DM模型的復制，發現80 mg/kg和100 mg/kg劑量下成模率均高于90 mg/kg，且二者成模率相近，本著節約成本原則，最終采用80 mg/kg進行腹腔注射。正常機體各項指標會維持在一個穩定的水平，而T2DM小鼠糖脂代謝發生紊亂，當給予西格列汀后，與模型組相比，TG、TC、LDL-C含量下降，HDL-C提升，FBG、FINS、HOMA-IR、GSP、C-P均有所不同程度的改善。

西格列汀作為第一個上市的DPP-4抑制劑[9]，通過抑制DPP-4活性，減少機體胰高糖素樣肽1（glucagon like peptide-1，GLP-1）分解，從而提高GLP-1水平，刺激胰島素分泌，達到降血糖的目的。該降糖作用具有葡萄糖依賴性，因此發生低血糖的風險較低，安全性高，與實驗室前期使用的二甲雙胍相比，胃腸道不良反應小，降低了在水迷宮實驗中小鼠因體力差異造成的實驗結果誤差。同時西格列汀還具有保護胰腺、肝臟、腎等器官及抗炎作用，GLP-1可抑制TNF-α等引起的炎性反應[10]。血糖升高會誘導小膠質細胞激活，激發炎癥反應，導致促炎因子分泌增加[11]，TNF-α、IL-6、IL-1β是關鍵的炎性因子。本實驗結果表明，與空白組相比較，模型組促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著增加。TNF-α、IL-6表達增加會破壞血腦屏障[12-13]，TNF-α還可通過增加神經興奮性引起海馬缺血性損傷，IL-1β可損害神經網絡結構[14]，這些炎性因子相互作用，產生聯級反應，發生神經炎癥，進一步導致認知受損。給予西格列汀藥物后DM小鼠腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β水平下降顯著。

本實驗聯合3種行為學方法進行學習記憶能力的測試。自主活動可反應中樞神經系統的興奮性，可清晰直觀地反映出T2DM鼠精神萎靡、不愛活動的特點；水迷宮是探究空間學習記憶能力的經典實驗，在精神科學領域廣泛應用[15]，該實驗方法記錄小鼠搜尋目標的時間和運動軌跡，有助于探究其學習、記憶、空間定向及認知能力；熱Y迷宮實驗裝置由本實驗室自主設計[16]，熱Y迷宮與傳統的Y迷宮相比，給予熱刺激可增加小鼠的運動趨向性，比八臂迷宮更為簡單，實用性強。自主活動、水迷宮及熱刺激聯合Y迷宮3種方法聯合使用，可提高行為學實驗結果的準確度。模型組部分小鼠出現毛色無光澤、精神萎靡、自發活動減少的現象，給予西格列汀藥液后小鼠毛色及精神狀態有所改善。行為學實驗結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠學習記憶能力出現異常；給予西格列汀的小鼠學習記憶能力得到改善，在熱刺激聯合Y迷宮實驗中小鼠學習和記憶能力的提高尤為明顯，這可能與西格列汀下調炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平，減輕小鼠腦部炎性損傷有關。

綜上，本實驗制備的T2DM小鼠模型表現出肥胖、高血糖、胰島素抵抗、行為學出現異常，提示復制的T2DM小鼠可作為探究T2DM小鼠的學習記憶能力的實驗模型。西格列汀能有效改善T2DM小鼠的糖脂代謝水平，并可能通過降低腦組織炎性因子水平提高T2DM小鼠的學習記憶能力。