微波輔助酸水解-HPLC測定紫肉甘薯中矢車菊素和芍藥素的含量

孫皓熠，孫敬勇，姚慶強

（山東第一醫科大學 藥學與制藥科學學院，山東省醫學科學院 藥物研究所，山東 濟南 250117）

紫肉甘薯（purple sweet potato）是栽培甘薯中一個具有獨特遺傳性狀和經濟價值的特色品種類型，因其塊根富含花青素（cyanidin），塊肉呈深紫色而得名[1]。國內學者稱其為紫心甘薯[2]或紫肉甘薯[3]。紫肉甘薯除了具有普通甘薯的生理保健功能外，還因其富含花色苷而具有許多重要的保健藥用價值。多方面研究表明，花色苷具有抗氧化活性，能清除體內產生有害物質的氧自由基；具有抗突變活性及抑菌、殺菌、抑制腫瘤活性；還具有防止血管緊張、恢復正常血壓，防止肝組織缺血、恢復肝功能正常及改善記憶等功能；還可用于放射防護等，且對人體沒有任何副作用[4-5]。

紫肉甘薯塊根中的花色苷有十幾種之多，主要組分均為矢車菊素和芍藥素，是由矢車菊素和芍藥素被槐糖和葡萄糖糖基化后再被咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸酰基化演變而來，兩者占其含量的90 %以上。由于紫肉甘薯色素成苷方式和酰基化的多樣性，采用色譜法直接測定需要復雜的儀器和多種標準品，成本昂貴[6-9]。通過水解多種花色苷為少數花青素單體，可方便準確地對花青素進行定量分析，從而降低檢測成本，簡化檢測步驟，但水解條件大多比較劇烈[10-12]，以致影響測定結果的準確性。

與傳統水解提取方法相比，微波輔助法具有快速高效、活性成分提取率高、適于熱不穩定性物質的提取及溶劑消耗少等優點[13]。本研究利用微波輔助酸水解法在常溫條件下快速提取紫肉甘薯中花青素，再直接將花色苷水解為花青素，并采用高效液相色譜（HPLC）對矢車菊素和芍藥素兩種成分進行了定量分析，以冀為紫肉甘薯資源的合理利用與質量控制提供更為準確和全面的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 600色譜泵，Waters 2487紫外檢測器，Waters 717自動進樣器（美國Waters公司）；METTLER AE240電子天平；紫外分光光度計島津UV-2201（日本島津）；Discover 2.0聚焦單模微波合成儀（美國CEM）；ZYUPH-I-10T超純水儀（四川卓越）。

1.2 試藥

10批紫肉甘薯采購來源見表1。經山東中醫藥大學高德民教授鑒定為旋花科植物甘薯[Ipomoea batatas(L.) Lam]的干燥塊根。矢車菊素和芍藥素對照品（百靈威，經二極管陣列檢測器進行峰純度檢測，均為單一成分峰，面積歸一化法計算其純度大于99.0 %）；色譜用超純水（自制）；乙腈（色譜純，美國TEDIA/天地化學試劑）；三氟乙酸（分析純，北京伊諾凱）；鹽酸（分析純，山東德康）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的矢車菊素對照品9.0 mg和芍藥素對照品20.4 mg，置入50 ml量瓶，加鹽酸甲醇（3→10）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液（濃度分別為0.18 mg/ml和0.408 mg/ml）。再分別精密量取上述對照品儲備液5 ml，置100 ml量瓶中，加鹽酸甲醇（3→10）稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（濃度分別為9.0 μg/ml和20.4 μg/ml）。

2.1.2 供試品溶液 取干燥的紫肉甘薯粉末（過100目篩）約1.0 g，精密稱定，置入100 ml反應瓶中，精密加入鹽酸甲醇溶液（3→10）20 ml，稱定重量，40 ℃微波水解，功率500 W，時間20 min，取出，放冷，再稱定重量，用鹽酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液（80:20）為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長538 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μl。矢車菊素和芍藥素的理論塔板數均大于5000，與相鄰雜質峰的分離度均大于1.5，色譜圖見圖1。

圖1 對照品和樣品HPLC圖譜

2.3 線性關系考察

分別精密吸取矢車菊素對照品溶液（濃度為9.0 μg/ml）和芍藥素對照品溶液（濃度為20.4 μg/ml）5，10，15，20，25 μl，按2.2項色譜條件測定，以峰面積和進樣量（μg）分別為縱坐標和橫坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程。矢車菊素回歸方程：Y=2 879 711.1X+2889.4，r=0.9998；芍藥素回歸方程：Y=2 485 421.6X+7643.2，r=0.9997。結果表明，矢車菊素進樣量在0.045～0.225 μg，芍藥素進樣量在0.102～0.510 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4 精密度試驗

取2.1.1項下對照品溶液，連續進樣測定6次，每次10 μl，并記錄峰面積。結果顯示矢車菊素峰面積的RSD為0.14 %（n=6），芍藥素峰面積的RSD為0.11 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取2.1.2項下供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，并記錄峰面積，結果矢車菊素峰面積的RSD為0.36 %（n=5），芍藥素峰面積的RSD為0.32 %（n=5），表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批紫肉甘薯（批號為6）粉末6份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.1.2項方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀進行測定。測得矢車菊素的平均含量為0.52 mg/g，RSD為2.0 %（n=6）；芍藥素的平均含量為1.23 mg/g，RSD為1.5 %（n=6）。表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收試驗

取已知含量的紫肉甘薯粉末（批號：6，矢車菊素含量為0.52 mg/g，芍藥素含量為1.23 mg/g）6份，各約0.5 g，精密稱定，置入100 ml反應瓶中，分別精密加入車菊素對照品儲備液和芍藥素對照品儲備液（濃度分別為0.18 mg/ml和0.408 mg/ml）各1.0，1.5，2.0 ml，再分別精密加入鹽酸甲醇（3→10）19.0，18.5，18.0 ml，按2.1.2項方法制備供試溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀進行測定，計算回收率。矢車菊素的平均回收率為98.6 %，RSD為0.88 %（n=6）；芍藥素平均回收率為98.8 %，RSD為1.2 %（n=6）。

2.8 樣品含量測定

取10批不同單位提供的紫肉甘薯樣品，分別按2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2項色譜條件測定，測定結果見表1。

表1 矢車菊素及芍藥素含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液處理方法的選擇與優化

試驗考察了鹽酸濃度、微波功率、水解時間及水解溫度等條件對水解效率的影響，發現當采用（3→10）鹽酸甲醇溶液、微波功率為500 W、微波水解時間20 min、水解溫度40 ℃條件水解時，測得的矢車菊素和芍藥素含量均最高，且水解產物中的雜質無干擾。

3.2 洗脫條件的選擇

試驗比較了甲醇-水、甲醇-0.1 %磷酸水溶液、甲醇-0.1 %三氟乙酸水溶液、乙腈-0.1 %醋酸水溶液、乙腈-0.1 %磷酸水溶液及乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液的洗脫效果，結果發現當以乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液洗脫時，所得色譜峰對稱性好，能達到基線分離，因此將乙腈-0.1 %三氟乙酸水溶液（80:20）做為流動相。

4 小結

建立了一種用鹽酸甲醇（3→10）微波水解-HPLC同時檢測紫肉甘薯中矢車菊素和芍藥素含量的方法，規避了傳統酸方法水解時間長、溫度高、花色素在水解過程中不穩定的技術難題。

本試驗測定了山東地區的10個批次的紫肉甘薯中矢車菊素和芍藥素的含量，10個批次的HPLC圖譜基本一致，但不同批次矢車菊素和芍藥素的含量有差異。綜上，該方法簡便、準確可靠、重復性強，為紫肉甘薯資源的合理利用與質量控制提供了更為準確和全面的參考依據。