基于網絡藥理學和實驗驗證探究金銀花-黃連治療咽炎的作用機制

劉曼婷，楊玉暢，胡盼祥，董曉旭，尹興斌，曲昌海，倪 健

（北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488）

金銀花（Lonicerae Japonicae Flos）味甘，性寒，具有清熱解毒，疏散風熱的功效，臨床用于治療喉痹，風熱感冒。黃連（Coptidis Rhizoma）味苦，性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效，臨床用于治療癰腫疔瘡，牙痛口瘡[1]。二者均為清熱藥，臨床常配伍使用。數據挖掘156首含黃連的處方中，配伍金銀花使用25首，如清營湯、銀花解毒湯、梔子金花丸等[2]。金銀花-黃連配伍的經典方劑最早來源于《外科發揮》的清咽利膈湯，主治急性咽喉痛，肺胃實熱，咽喉紅腫疼痛，痰涎壅盛。通過《中醫方劑大辭典》數據挖掘，已知金銀花、黃連均是喉痹內服方劑中使用頻數＞20的中藥[3]。現代藥理學研究發現，二者可抑制痢疾桿菌，提高機體體液免疫和細胞免疫及網狀內皮系統的吞噬功能，可合用治療喉嚨腫痛[4-6]。咽炎（pharyngitis）是咽部黏膜、黏膜下組織及其淋巴組織由病毒、細菌、真菌（如肺炎支原體、A組鏈球菌）等感染引起的非特異性炎癥，常為肺炎等疾病的前驅癥狀[7-8]。網絡藥理學是依托系統生物學，從三維整體觀探究中藥多成分、多靶點、多通路協作機制，構建分析“成分-基因-疾病”的多維度生物機制網絡，從而降低藥物的研發成本，指導臨床精準用藥[9-11]。本研究采用網絡藥理學方法構建金銀花-黃連的可視化網絡，解析金銀花-黃連治療咽炎的活性成分、作用靶標、生物學機制，并進行初步動物實驗驗證，以期闡明其治療咽炎的效應機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫

數據庫信息見表1。

表1 數據庫信息

1.2 化學成分的篩選與核對

登錄TCMSP搜索金銀花、黃連的有效成分，設置DL≥0.18，OB≥30 %，對有效成分進行篩選，將所得成分的結構輸入Pubchem核對結構、名稱、分子式，最終獲得關鍵化合物。

1.3 潛在靶點的預測與篩選

將關鍵化合物的信息輸入Pharm Mapper數據庫，獲得候選基因的靶點信息，并通過Uniprot數據庫進行標準化處理，再與通過Genecards數據庫篩選出咽炎的靶點基因進行映射，得到藥物-疾病候選基因的VENN圖。

1.4 構建多水平網絡系統

1.4.1 PPI網絡構建 將金銀花-黃連與咽炎的潛在靶點基因導入STRING數據庫，設置物種為人類（Homosapiens），獲得蛋白互作關系網絡，設置蛋白關系評分為0.4，隱藏游離蛋白，篩選排名前15的核心基因。

1.4.2 “藥物-化合物-靶點-疾病”網絡構建 使用Cytoscape 3.7.1軟件對所得信息進行三維網絡處理，使“藥物-化合物-靶點-疾病”的關系以網絡圖的形式呈現。在這個網絡圖中，將關鍵化合物和靶點設置為節點，邊代表節點之間相互作用的關系。

1.5 靶點通路富集分析

將潛在靶點基因輸入DAVID數據庫，并指定物種為“Homosapiens”，界定閾值P＜0.05，將分析結果繪制成氣泡圖，圖中基因數用氣泡大小表示，P值高低用氣泡顏色表示。

1.6 分子對接前處理

在RCSB 蛋白數據庫中輸入蛋白互作網絡圖中度值前三的靶蛋白名稱，選取最高分辨率的靶蛋白結構，使用Pymol軟件預處理：（1）去除水分子；（2）去除原配體分子；（3）運行AutoDockTolls 4.2.6為受體分子加極性氫；利用 Chem3D將關鍵成分文件轉化為mol2格式。

1.7 分子對接

將前處理后的配體和關鍵靶點導入AutoDock 4.2.6進行格點能計算，進行分子對接。以最低結合能作為靶蛋白和配體對接的結果，使用Pymol軟件進行可視化處理。

1.8 動物實驗驗證

1.8.1 實驗動物 SD大鼠36只，雄性，SPF級，體重200±20 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2022-0010。

1.8.2 主要藥品與試劑 黃連飲片（批號：501002642，北京同仁堂藥材有限責任公司）；金銀花（批號：20180427，北京本草方源藥業集團有限公司）；大鼠基質金屬蛋白酶2 ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；大鼠白介素2（IL-2）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；阿司匹林（上海上藥信誼藥廠有限公司）。

1.8.3 藥物制備 參考文獻[12]，以水提醇沉的方法制備黃連-金銀花浸膏粉，黃連與金銀花的質量比為1:2，加水煎煮3次，每次加8倍量水煎煮1 h，合并藥液，加入乙醇使含醇量達50 %，置于4 ℃冰箱過夜，過濾雜質，減壓旋蒸、真空干燥得到干浸膏粉，每克含生藥材3.1 g，置陰涼干燥處密封保存。

1.8.4 造模與給藥 取36只正常SD大鼠隨機分為6組，分別為空白對照組，模型組，高、中、低劑量金銀花-黃連組，阿司匹林陽性對照組，每組6只。正常組大鼠咽部噴生理鹽水，其余組大鼠造急性咽炎模型，用喉頭噴霧器向其咽部噴霧25 %氨水，2次/d，上午、下午各1次，每次噴3下，連續噴3 d，大鼠造模成功的標志為咽部黏膜出血、紅腫[13]。于第4天起，對大鼠進行灌胃給藥，每天1次，連續給藥7 d，高、中、低劑量給藥組分別給予金銀花-黃連浸膏粉2.8，1.4，0.7 g/(kg·d)，陽性對照組給予阿司匹林200 mg/kg，空白對照組和模型組給予生理鹽水10 ml/kg。

1.8.5 觀測指標 實驗過程中每天觀察并記錄各組動物飲食情況、活動情況、咽部黏膜狀態（包括顏色、分泌物等）。大鼠灌胃1周后腹主動脈取血，血液室溫自然凝固10～20 min后，3000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清，按試劑盒說明書操作，采用ELISA法測定各組大鼠血清中基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、IL2的含量。

1.8.6 統計學方法 實驗數據統一采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多組間數據采用單因素方差分析；各組間的兩兩比較，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane’s檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金銀花-黃連關鍵化合物的篩選

本研究初步篩選出關鍵化合物37個，其中包括黃連的關鍵化合物14個，金銀花的關鍵化合物23個。經與Pubchem核對后共得33個關鍵化合物，表2為關鍵化合物信息采集表。

表2 金銀花-黃連中的關鍵化合物

2.2 潛在治療靶點基因的預測

在TCMSP平臺下載關鍵化合物的信息以“mol2”的格式導入Pharm Mapper數據庫，獲得802個靶標信息，經刪除重復項剩余183個，并以此構建關鍵化合物靶標信息數據庫，通過Uniprot進行基因ID的標準化核對，并使用R語言校準。通過Genecards數據庫檢索咽炎的靶點基因，輸入“pharyngitis”，獲取基因共1803個，將金銀花-黃連與咽炎的靶點基因進行映射，得到金銀花-黃連-咽炎的潛在治療靶點基因共46個（見表3），并通過R語言繪制成VENN圖（見圖1）。

表3 金銀花-黃連治療咽炎的潛在靶點基因

圖1 金銀花-黃連靶標與咽炎靶標的韋恩圖

2.3 PPI網絡構建

PPI網絡圖見圖2。該網絡包含207條邊，46個節點，靶蛋白平均度值為9，有22個靶蛋白的度值超過9（見圖3），說明這22個靶蛋白是PPI網絡中的重要靶點。

圖2 金銀花-黃連潛在治療靶點的相互作用網絡

圖3 金銀花-黃連治療咽炎的重要靶點

2.4 繪制作用機制可視化網絡

將篩選獲得的藥物活性成分、潛在治療靶點基因、藥物、疾病名稱導入Cytoscape 3.7.1軟件，設置節點與邊線，將其相互關系繪制成可視化“藥物-化合物-靶點-疾病”網絡圖（見圖4）。網絡共涉及節點（Nodes）77個，邊線（Edges）378條，其中長方形節點代表潛在治療靶點基因，菱形節點代表藥物活性成分，圓形節點代表藥物，三角形節點代表疾病，邊線表示化合物、靶點、藥物、疾病之間存在相關性。通過插件cytoNCA按度（degree）、緊密度（closeness）兩種屬性分別取平均值排序，篩選兩者均大于平均值（分別為9.82和106.03）且靠前的成分或者靶點。成分有obacunone（黃柏酮）、palmidin A（掌葉二蒽酮A）、caeruloside C、quercetin（槲皮素），靶點有HRAS。

圖4 中藥-成分-靶點-疾病網絡圖

2.5 Go與KEGG通路分析

共獲得GO條目48個（P＜0.05），涉及生物過程（BP）條目34個，細胞組成（CC）條目6個，分子功能（MF）條目8個，分別占72 %，11 %，17 %，根據P值由小到大篩選排名前20的通路繪制氣泡圖（見圖5～7），未滿足20條通路的功能選取其所有通路。含靶點數量越多的通路對咽炎的治療潛力越大，生物過程分析中（見圖5）靶點富集數目較多的有蛋白水解（proteolysis）、細胞增殖調控（regulation of cell proliferation）、凋亡過程負調控（negative regulation of apoptotic process）；分子功能分析（見圖6）中靶點富集數目較多的有鋅離子結合（zinc ion binding）、ATP結合（ATP binding）、受體結合（receptor binding）；細胞組分分析（見圖7）中靶點富集數目較多的有細胞外基質（extra cellular matrix）、內吞小泡（endocyticvesicle）、膜筏（membraneraft）。

圖5 金銀花-黃連潛在靶標的生物功能富集分析

圖6 金銀花-黃連潛在靶標的分子功能富集分析

圖7 金銀花-黃連潛在靶標的細胞組分富集分析

KEGG通路富集篩選得到48條信號通路（P＜0.05），根據P值由小到大篩選排名前20的通路繪制氣泡圖（見圖8），經分析得雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、促性腺激素釋放激素信號通路（GnRH signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway），這4條信號通路是治療咽炎的主要通路。

圖8 金銀花-黃連潛在靶標的KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結果

結果見表 4，表示活性化合物和靶蛋白具有結合能力。結果表明，靶蛋白與活性成分之間結合活性度越高，最低結合能的絕對值就會越低，說明兩者之間結合能力越好。圖9表示靶蛋白與活性化合物對接最好的組合，結果顯示，黃柏酮、掌葉二蒽酮A等與抗咽炎藥物潛在作用靶點具有自發的親和力。

圖9 Obacunone與MMP-2、Palmidin A與MAPK1、Obacunone與EGFR的結合模式

表4 關鍵靶點與關鍵化合物的對接結果

2.7 動物實驗驗證結果

2.7.1 各組大鼠一般情況與癥狀表現 造模3 d后，正常組大鼠正常飲食，活動正常，咽部黏膜形態正常，未見分泌物；模型組大鼠食欲下降，精神欠佳，咽部黏膜出現充血、腫脹，黏液分泌增多，同時伴有搔抓口部的現象。灌胃1周后，金銀花-黃連各劑量給藥組、阿司匹林組大鼠咽部黏膜的紅腫狀態均有不同程度減輕。

2.7.2 各組大鼠血清中MMP-2和IL-2水平 上述網絡藥理學結果表明黃連-金銀花可能作用于MMP-2、IL-2等靶點發揮抗咽炎的作用，本研究進一步驗證了金銀花-黃連對急性咽炎大鼠血清中MMP-2、IL-2水平的影響，見表5。由表5可見，模型組大鼠血清中的MMP-2和IL-2水平較正常組升高（P＜0.05），另外阿司匹林組及JYH-HL各劑量給藥組大鼠血清中的MMP-2和IL-2含量較模型組降低（P＜0.05），提示金銀花-黃連能降低急性咽炎大鼠血清中IL-2和MMP-2的表達。

表5 各組大鼠血清中MMP-2和IL-2含量（ ±s，n=6）

表5 各組大鼠血清中MMP-2和IL-2含量（ ±s，n=6）

注：與空白對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

組別 MMP-2/pg·ml-1 IL-2/pg·ml-1空白對照組 536.32±41.34 24.71±3.45模型組 720.78±39.67# 36.88±3.97#金銀花-黃連高劑量組 613.63±53.78* 28.69±2.56*金銀花-黃連中劑量組 654.78±58.43* 31.02±2.88*金銀花-黃連低劑量組 686.98±40.12* 32.74±1.37*阿司匹林組 624.12±47.86* 27.04±2.41*

3 討論與結論

本研究通過可視化網絡分析篩選出金銀花-黃連治療咽炎的4個潛在活性成分，分別為黃柏酮（obacunone）、掌葉二蒽酮A（palmidin A）、caeruloside C、槲皮素（quercetin）。通過PPI篩選發現MAPK1、EGFR、MMP-2、IL-2、HRAS、CASP3、ALB等是金銀花-黃連治療咽炎的關鍵靶點。

綜上，金銀花-黃連治療咽炎的作用機制可能是其有效成分黃柏酮、掌葉二蒽酮A、Caeruloside C、槲皮素通過MAPK1、EGFR、MMP-2、IL2、HRAS、CASP3、ALB等關鍵蛋白介導雌激素信號通路、GnRH信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、T細胞受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等協作產生抗炎、免疫殺傷、黏膜修復、運化外毒素等直接作用以及黏附緩釋等間接作用來防治咽炎。