外源褪黑素誘導(dǎo)下Hippo信號通路調(diào)控山羊絨生長mRNA和lncRNA的生物信息學(xué)分析

賈純琰 付紹印 麗 春 張文廣

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室, 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 包頭 014109;3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院, 呼和浩特 010031;4.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動物科技學(xué)院, 內(nèi)蒙古 通遼028000;5.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)基因組大數(shù)據(jù)工程研究中心, 呼和浩特 010000)

絨山羊基因組中潛藏著大量不能翻譯成蛋白質(zhì),但可轉(zhuǎn)錄成RNA并在RNA水平行使調(diào)控功能的非編碼RNA。目前對褪黑素調(diào)控山羊絨生長的非編碼RNA的研究逐漸增多。褪黑素通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)誘導(dǎo)內(nèi)蒙古絨山羊二次生絨[16];通過調(diào)節(jié)lncRNA MTC的表達(dá)激活NF-κB信號通路,從而調(diào)控遼寧絨山羊毛囊發(fā)育與羊絨生長[17];通過改變let-7家族重要成員的表達(dá)影響相應(yīng)靶基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控內(nèi)蒙古絨山羊皮膚毛囊的周期性生長[18];與lncRNA lnc552通過Wnt信號通路調(diào)控陜北白絨山羊毛囊干細(xì)胞增殖與分化[19]。

在以往的褪黑素促山羊絨生長的研究中,更多關(guān)注能編碼蛋白的mRNA功能,對不參與蛋白編碼的lncRNA的功能研究較少;且以往的研究模式多為單個基因,很少從整體的、系統(tǒng)的角度研究所有基因間的互作;而以往研究調(diào)控山羊絨生長的信號通路中很少聚焦Hippo信號通路。Hippo信號通路對平衡哺乳動物皮膚生長和分化,調(diào)節(jié)毛囊形態(tài)發(fā)生至關(guān)重要[20],也是哺乳動物組織生長發(fā)育和分化過程中整合激素的一個關(guān)鍵元素。褪黑素信號和Hippo信號通路之間存在潛在的串?dāng)_[21]。本研究旨在從轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面全面挖掘褪黑素作用下調(diào)控山羊絨生長的mRNA和lncRNA,揭示調(diào)控山羊絨生長的關(guān)鍵信號通路,可視化受Hippo信號通路調(diào)控的山羊絨生長候選基因集的mRNA和lncRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系,以期為深入探索褪黑素促絨生長的機(jī)理提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

6只成年試驗?zāi)秆蜻x自內(nèi)蒙古罕山白絨山羊種羊場,隨機(jī)分為對照組(C1、C2、C3)和褪黑素處理組(M1、M2、M3)各3個生物學(xué)重復(fù)。在阿魯科爾沁旗牧戶家放牧飼養(yǎng)。收牧后每天進(jìn)行補(bǔ)飼,粗飼料以苜蓿草、玉米秸稈和當(dāng)?shù)夭莸厣系碾s草為主,精料主要是玉米。以自然年(完整的絨毛生長周期)為試驗周期,每隔一個月按照每千克體重2 mg的劑量,使用獸用皮下埋植器(江蘇泰興市醫(yī)用器械廠)在試驗羊(M1、M2、M3)耳后皮下埋植褪黑素(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院左家特產(chǎn)研究所研制)。每月用剪毛剪刀在試驗羊肩胛骨后緣接近體中線處貼近皮膚剪下1 cm×1 cm 面積的全毛,并用剃刀將皮膚上殘留的絨毛刮干凈,酒精擦拭、碘酒消毒,用手術(shù)刀片割取1 cm×1 cm 面積的皮膚樣本(傷口同時迅速涂抹云南白藥粉止血),迅速放入5 mL無菌凍存管中,立即保存于液氮罐帶回實驗室,再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。對照組和褪黑素處理組全年12個月的樣本分別記為C1～C12和M1～M12。

1.2 方法

1.2.1 RNA制備、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序

使用TRIZOL(Invitrogen)對72份皮膚組織樣本進(jìn)行RNA提取。RNA Nano 6 000試劑盒(Agilent)檢測RNA樣品的完整性和濃度,Ribo-ZeroTM試劑盒去除rRNA,RNA文庫制備試劑盒(NEB)構(gòu)建cDNA文庫,Illumina HiSeq 2500測序儀進(jìn)行雙端測序。

1.2.2 質(zhì)控、組裝轉(zhuǎn)錄組

對日光溫室茄子栽培技術(shù)進(jìn)行研究，特別是在育苗、定植、施肥、澆水以及后期的收獲和管理中要科學(xué)分析，并借助生物防治以及化學(xué)防治的方式防治病蟲害，避免大面積的病蟲害感染影響茄子的產(chǎn)量和質(zhì)量。

使用FASTQC軟件對RNA-seq產(chǎn)生的原始下機(jī)序列(Raw Reads)質(zhì)控得到高質(zhì)量序列(Clean Reads)。Bowtie2(v2.2.3)程序建立參考基因組的索引,山羊參考基因組(CHIR_2.0)及基因組gtf注釋文件從NCBI下載(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=goat),Tophat2(v2.1.1)程序?qū)㈦p端測序的 clean reads比對到參考基因組[22]。Cufflinks (v2.2.1) 程序依托參考基因組的gtf注釋文件組裝出轉(zhuǎn)錄組[23]。

1.2.3 篩選差異表達(dá)mRNA和lncRNA

使用Cuffdiff (v2.2.1) 程序分析絨山羊皮膚中自然年每月對照組和埋植組的差異表達(dá)mRNA(Differentially expressed mRNA, DE-mRNA)和轉(zhuǎn)錄本(FDR<0.05)[24],Cuffcompare (v2.2.1) 程序?qū)Σ町惐磉_(dá)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類,篩選類別代碼是“i”、“j”、“o”、“u”、“x”的作為新轉(zhuǎn)錄本的候選。CPAT (v1.2.2)程序和在線CPC (http:∥cpc.cbi.pku.edu.cn)識別差異表達(dá)lncRNA(Differentially expressed lncRNA, DE-lncRNA)。

1.2.4 DE-mRNA和DE-lncRNA的PCA及WGCNA分析

2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)的主成分分析(Principal component analysis, PCA)由R(v3.4.0)軟件完成。依據(jù)WGCNA官網(wǎng)教程(http:∥www.genetics.ucla.edu/labs/horvath/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA)由R軟件(v3.4.0)完成DE-mRNA和DE-lncRNA的WGCNA分析[25]。函數(shù)PickSoftThreshold進(jìn)行無尺度拓?fù)浞治?選擇軟閾值β=7調(diào)用函數(shù)adjacency計算基因間的鄰接性,函數(shù)TOMdist將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣(Topological overlap matrix, TOM)[26]。基于TOM矩陣調(diào)用函數(shù)hclust繪制基因聚類樹狀圖,聚類樹的分枝是表達(dá)模式相似的一組基因即基因模塊[27]。函數(shù)ModuleEigengenes計算模塊的特征基因值,通過模塊特征基因值的相關(guān)性對模塊聚類以研究模塊之間的關(guān)系。采用基于Java運行環(huán)境的Cytoscape(v3.6.0)軟件插件ClueGo(v3.4.2)進(jìn)行基因模塊的功能富集分析[28]。選取平衡哺乳動物皮膚生長和分化、調(diào)節(jié)哺乳動物毛囊形態(tài)發(fā)生的Hippo信號通路基因模塊進(jìn)行深入分析[29]。

1.2.5 可視化調(diào)控山羊絨生長的候選基因集

由R軟件 (v3.4.0) 導(dǎo)出單個目標(biāo)模塊的全部加權(quán)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,即對照組品紅色(Magenta)基因模塊,埋植組深藍(lán)色(Mid-night-blue)、棕褐色(Tan)和橙色(Salmon)基因模塊。Excel(v2016)篩選對照組品紅色(Magenta)基因模塊邊(edges)的信息文件中,與富集到Hippo信號通路的17個基因、皮膚發(fā)育的18個基因、細(xì)胞周期的14個基因、中間纖維的14個基因中的每一個基因Weight值(即TOM值)排名Top10的基因。埋植組操作同上。

1.2.6 調(diào)控山羊絨生長候選基因集的功能透視

由R軟件(v 4.1.2)AnnotationHub程序包構(gòu)建山羊OrgDb,clusterProfiler程序包獲取山羊GO數(shù)據(jù)庫里GO.BP皮膚發(fā)育和GO.CC中間纖維的gene list[30]。KEGGREST程序包獲取山羊Hippo信號通路chx04390、細(xì)胞周期chx04110、氧化磷酸化chx00190、Wnt信號通路chx04310的gene list。dplyr程序包制作gmt文件給GSEA(Gene set enrichment analysis)軟件(v 4.1.0)進(jìn)行分析。R軟件(v4.1.2)pheatmap程序包完成候選基因集與樣本的關(guān)聯(lián)分析。候選基因集中轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子的注釋基于動物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(http:∥bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB)[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中DE-mRNA和DE-lncRNA

分析埋植組和對照組的全年絨山羊皮膚組織樣本共篩選得到2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA(FDR<0.05)。DE-mRNA(圖1(a))和DE-lncRNA(圖1(b))火山圖的每個點分別代表1個mRNA和1個lncRNA。與對照組相比,受外源褪黑素影響,表達(dá)量顯著上調(diào)2倍及以上的mRNA有522個(圖1(a)紅點)、lncRNA有128個(圖1(b)紅點),表達(dá)量顯著下調(diào)2倍及以上的mRNA有400個(圖1(a)綠點)、lncRNA有81個(圖1(b)綠點),表達(dá)量上調(diào)及下調(diào)小于2倍的mRNA有1 102個(圖1(a)灰點)、lncRNA有120個(圖1(b)灰點)。

圖1(a)和圖1(b)紅色點表示上調(diào)2倍及以上的mRNA和lncRNA即log2FC≥1;綠色點表示下調(diào)2倍及以上的mRNA和lncRNA即log2FC≤-1;log2FC介于-1和1之間的mRNA和lncRNA用灰色點表示。The red dots in figures 1(a) and 1(b) indicated that mRNA和lncRNA were up-regulated by two times or more, i.e. log2FC≥1; the green dots indicated that mRNA和lncRNA were down-regulated by two times or more, i.e. log2FC≤-1; the mRNA和lncRNA with log2FC between -1 and 1 were represented by gray dots.圖1 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中差異表達(dá)mRNA(a)和差異表達(dá)lncRNA(b)的火山圖Fig.1 Volcano plot of DE-mRNA (a) and DE-lncRNA (b) induced by exogenous melatonin in cashmere goat skin

2.2 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中DE-mRNA和DE-lncRNA的PCA分析

基于2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA的RNA-Seq表達(dá)量數(shù)據(jù)共同加權(quán)得到主成分1(Dim1)和主成分2(Dim2),埋植組和對照組的全年24個樣本聚類的二維PCA散點圖(圖2)。Dim1 和Dim2分別占總體方差變異的39.9%和12.8%,Dim1+Dim2占總體方差的50%以上,既實現(xiàn)了降低數(shù)據(jù)維度為二維,又保證了信息損失最小。與埋植組相比,對照組樣本更離散(紅色散點),對照組來自正常生理狀態(tài)下絨山羊皮膚組織,對次級毛囊生長周期的變化更敏感,5～7月(生長前期)、8～9月(生長期)、10～12月(生長旺盛期)、1～2月(退行期)、3～4月(休止期)聚集在一起,這應(yīng)答了次級毛囊的正常生長周期。相比之下,埋植組的樣本處于相同的狀態(tài)(外源褪黑素誘導(dǎo)下)聚類在一起(綠色散點),4～7月(產(chǎn)夏季絨)、8～12月(產(chǎn)冬季絨)、1～3月(休止期)聚在一起,這應(yīng)答了褪黑素埋植組的產(chǎn)絨周期。此結(jié)果表明DE-mRNA和DE-lncRNA應(yīng)答了絨山羊皮膚次級毛囊的生長周期。

對照組和埋植組全年12個月的樣本分別以C1～C12和M1～M12表示。The 12-month samples of the control and implanted group were expressed as C1-C12 and M1-M12, respectively.圖2 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中差異表達(dá)mRNA和差異表達(dá)lncRNA的PCA散點圖Fig.2 PCA scatter plot of DE-mRNA and DE-lncRNA induced by exogenous melatonin in cashmere goat skin

2.3 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中DE-mRNA和DE-lncRNA的WGCNA分析

2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA經(jīng)WGCNA分析,對照組和埋植組分別得到7個和9個高度關(guān)聯(lián)的基因模塊,每個基因模塊都有唯一的顏色標(biāo)識,其余關(guān)聯(lián)較差的基因被歸入灰色模塊結(jié)果見表1。表1的基因模塊經(jīng)ClueGo功能富集分析,選取富集到Hippo信號通路的對照組品紅色(Magenta)模塊和埋植組深藍(lán)色(Mid-night-blue)模塊進(jìn)行深入分析,目標(biāo)模塊顯著富集到的GO條目或KEGG通路結(jié)果見表2。

表1 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中mRNA和lncRNA在各基因模塊的分布Table 1 Assignment of mRNA和lncRNA in each gene module induced byexogenous melatonin in cashmere goat skin

表2 受外源褪黑素誘導(dǎo)的絨山羊皮膚中目標(biāo)基因模塊的功能注釋Table 2 Functional annotations enriched in target modules induced by exogenous melatonin in cashmere goat skin

表2(續(xù))

對照組基因模塊的特征基因樹狀圖(圖3(a))與基因模塊間的鄰接熱圖(圖3(a))品紅色(Magenta)Hippo目標(biāo)基因模塊是獨立發(fā)揮作用,不與其他基因模塊互作。外源褪黑素改變了基因模塊間的相互作用模式,埋植組基因模塊的特征基因樹狀圖(圖3(b))與基因模塊間的鄰接熱圖(圖3(b))深藍(lán)色(Mid-night-blue)Hippo目標(biāo)基因模塊與橙色(Salmon)和棕褐色(Tan)基因模塊存在互作,且基因模塊間特征基因相關(guān)度在0.5以上。

此結(jié)果表明深藍(lán)色(Mid-night-blue)Hippo基因模塊是與橙色(Salmon)氧化磷酸化基因模塊和棕褐色(Tan)細(xì)胞周期基因模塊協(xié)同發(fā)揮作用。

2.4 可視化褪黑素調(diào)控山羊絨生長的候選基因集

褪黑素調(diào)控山羊絨生長候選基因集的mRNA和lncRNA共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖4,由3個獨立的同心圓網(wǎng)絡(luò)組成,同心圓從左至右分別對應(yīng)圖3(b)的深藍(lán)色(Mid-night-blue)Hippo基因模塊、棕褐色(Tan)細(xì)胞周期基因模塊與橙色(Salmon)氧化磷酸化基因模塊。居左的同心圓是82個mRNA和20個lncRNA的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),由內(nèi)而外,第一環(huán)紫色V形節(jié)點是目標(biāo)生物學(xué)過程皮膚發(fā)育、目標(biāo)通路Hippo信號通路;第二環(huán)橙色菱形節(jié)點是對照組和埋植組共有的7個lncRNA;第三環(huán)淺綠色菱形節(jié)點是埋植組特有的13個lncRNA;第四環(huán)紅色圓形節(jié)點是對照組和埋植組共有的51個mRNA;第五環(huán)綠色圓形節(jié)點是埋植組特有的31個mRNA。居中的同心圓是87個mRNA和27個lncRNA的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),由內(nèi)而外,第一環(huán)紫色V形節(jié)點是目標(biāo)細(xì)胞組分中間纖維、目標(biāo)通路細(xì)胞周期;第二環(huán)橙色菱形節(jié)點是對照組和埋植組共有的7個lncRNA;第三環(huán)淺綠色菱形節(jié)點是埋植組特有的20個lncRNA;第四環(huán)紅色圓形節(jié)點是對照組和埋植組共有的46個mRNA;第五環(huán)綠色圓形節(jié)點是埋植組特有的41個mRNA。居右的同心圓是22個mRNA和2個lncRNA的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),由內(nèi)而外,第一環(huán)紫色V形節(jié)點是目標(biāo)通路氧化磷酸化;第二環(huán)淺綠色菱形節(jié)點是埋植組特有的2個lncRNA;第三環(huán)綠色圓形節(jié)點是埋植組特有的22個mRNA。此結(jié)果表明外源褪黑素誘導(dǎo)下,這191個mRNA和49個lncRNA由Hippo信號通路、細(xì)胞周期和氧化磷酸化過程介導(dǎo),協(xié)調(diào)互作調(diào)控山羊絨生長的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

圖3 不同組基因模塊的特征基因樹狀圖與基因模塊間的鄰接熱圖Fig.3 Eigengene dendrogramand adjacency heatmap of gene module of different groups

紫色V形節(jié)點表示通路、生物學(xué)過程、細(xì)胞組分;紅色和橙色節(jié)點分別表示在對照組和埋植組共有的mRNA和lncRNA;綠色節(jié)點和淺綠色節(jié)點分別表示在埋植組特有的mRNA和lncRNA。圓形節(jié)點表示mRNA;菱形節(jié)點表示lncRNA。節(jié)點的大小表示基因的連通度,節(jié)點越小基因的連通度越低。The purple V-shaped nodes indicated pathways, biological processes and cell components; The common mRNA and lncRNA in the control group and the implanted melatonin group were indicated by red and orange nodes respectively; The exclusive mRNA and lncRNA in the implanted melatonin group were indicated by green and light green nodes respectively. The round nodes indicated mRNA; The diamond nodes indicated lncRNA. Node size indicated the degree of gene, low degree map to small node.圖4 褪黑素調(diào)控山羊絨生長候選基因集mRNA和lncRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Co-expression networks of mRNA and lncRNA induced by melatonin in the candidate gene set that regulated cashmere growth

2.5 調(diào)控山羊絨生長候選基因集的功能透視

2.5.1 候選基因集的GSEA分析

調(diào)控山羊絨生長候選基因集的GSEA分析結(jié)果見表3,與埋植組相比,對照組更加富集于皮膚發(fā)育生物學(xué)過程和中間纖維細(xì)胞組分;與對照組相比,埋植組更加富集于Hippo信號通路、Wnt信號通路、細(xì)胞周期、氧化磷酸化和呼吸鏈復(fù)合體細(xì)胞組分。

皮膚發(fā)育和中間纖維的富集評分(Enrichment score,ES)為正值,這2個基因集的成員在對照組呈上調(diào)趨勢。候選基因集在對照組的表達(dá)與皮膚發(fā)育生物學(xué)過程顯著關(guān)聯(lián)(|NES|>1且FDR<25%),與中間纖維細(xì)胞組分關(guān)聯(lián)(|NES|>1且FDR=0.41)(表3)。此結(jié)果表明這2個基因集成員對候選基因集在正常生理狀態(tài)下的山羊絨生長有貢獻(xiàn)。

Hippo信號通路、Wnt信號通路、細(xì)胞周期、氧化磷酸化和呼吸鏈復(fù)合體的ES為負(fù)值,這5個基因集的成員在埋植組呈上調(diào)趨勢。候選基因集在埋植組的表達(dá)與Hippo信號通路(|NES|>1且FDR<25%)、Wnt信號通路(|NES|>1且FDR<25%)、細(xì)胞周期(|NES|>1且FDR<25%)顯著關(guān)聯(lián),與氧化磷酸化(|NES|>1且FDR=0.30)和呼吸鏈復(fù)合體細(xì)胞組分(|NES|>1且FDR=0.38)關(guān)聯(lián)(表3)。此結(jié)果表明這5個基因集成員對候選基因集在外源褪黑素誘導(dǎo)下的山羊絨生長有貢獻(xiàn)。

表3 候選基因集GSEA富集評分Table 3 GSEA enrichment score of candidate gene set

2.5.2 定量候選基因集與樣本的關(guān)聯(lián)

調(diào)控山羊絨生長候選基因集的253個mRNA和59個lncRNA與樣本的關(guān)聯(lián)熱圖,及候選基因集的核心基因、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔因子之間的聚類模式見圖5。對照組和埋植組候選基因集的全部312個基因被聚成兩類(圖5),一類為212個mRNA和50個lncRNA與正常山羊絨生長期(8～12月)的樣本呈正相關(guān),這262個基因促進(jìn)正常生理狀態(tài)下的山羊絨生長;另一類為41個mRNA和9個lncRNA與正常山羊絨生長期(8～12月)的樣本呈負(fù)相關(guān),這50個基因負(fù)調(diào)控山羊絨生長。對照組絨山羊8月開始長絨,8～12月皮膚次級毛囊處于生長期及生長旺盛期。結(jié)果表明,候選基因集與對照組樣本的關(guān)聯(lián)結(jié)果與生理性狀一致,候選基因集參與調(diào)控正常生理狀態(tài)下絨山羊產(chǎn)絨期的絨生長。絨山羊皮膚埋植褪黑素后,候選基因集的312個基因間的互作模式發(fā)生了明顯改變,這些基因以不同于對照組的方式被聚成兩類(圖5),協(xié)調(diào)互作與非生絨期(4～7月)及正常生絨期(8～12月)的樣本呈正相關(guān),在外源褪黑素誘導(dǎo)下促進(jìn)非產(chǎn)絨期和正常產(chǎn)絨期的絨生長。埋植褪黑素后改變了羊絨的生長模式,除正常生絨期外,在4～7月(非產(chǎn)絨期)也生長了一批羊絨。結(jié)果表明,候選基因集與埋植組樣本的關(guān)聯(lián)結(jié)果與生理性狀一致,證明外源褪黑素誘導(dǎo)下候選基因集參與調(diào)控非產(chǎn)絨期和正常產(chǎn)絨期的絨生長。

C表示對照組;M表示埋植組;Hub表示核心基因;TF表示轉(zhuǎn)錄因子;TF co表示轉(zhuǎn)錄輔因子。每一行對應(yīng)一個基因,每一列對應(yīng)一個樣本。熱圖的每個單元格根據(jù)圖例顏色展示基因與樣本的相關(guān)性。C represented the control group; M represented the implant group; Hub represented hub gene; TF represented transcription factor; TF co(TF cofactor) represented transcription cofactor. Each row corresponded to a gene, column to a sample. Each cell of heat map was color-coded by correlation according to the color legend.圖5 調(diào)控山羊絨生長候選基因集與樣本的關(guān)聯(lián)熱圖Fig.5 The heat map between the gene set that regulated cashmere growth and samples

3 討 論

褪黑素是由皮膚產(chǎn)生并可在皮膚中進(jìn)行代謝的胺類激素,可促進(jìn)山羊絨生長。lncRNA在調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[32]。同為研究褪黑素介導(dǎo)lncRNA對山羊絨生長的影響,Jin等[17]研究的皮膚樣本取自山羊絨生長期,而本研究不僅對非羊絨生產(chǎn)期的山羊皮膚進(jìn)行了試驗,還將試驗范圍擴(kuò)大到非羊絨生產(chǎn)期之前和之后的整個羊絨生長周期。與10～3月相比,4～9月的DE-mRNA和DE-lncRNA數(shù)量較多, 其中5月最多(DE-mRNA共計1 178個,DE-lncRNA共計191個),其余11個月(除5月)的DE-mRNA共2 293個和DE-lncRNA共331個,其余11個月(除5月)DE-mRNA的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分別為208.45和200.93,1 178大于811.24(μ±3σ),P<0.01,其余11個月(除5月)DE-lncRNA的平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分別為30.09和23.97,191大于101.99(μ±3σ),P<0.01,根據(jù)Z檢驗5月與其余11個月相比差異極顯著。這說明與對照組相比,受外源褪黑素影響絨山羊皮膚組織在5月發(fā)生了極其重要的生理事件。在正常生理狀態(tài)下,罕山白絨山羊5月脫絨,7月體表開始長出過冬絨毛。埋植褪黑素導(dǎo)致提前一個月脫絨,5月體表已經(jīng)長出夏季絨毛。發(fā)現(xiàn)DE-lncRNA和DE-mRNA在全年每月分布的變化趨勢相似,推測受外源褪黑素影響lncRNA和mRNA協(xié)同發(fā)揮作用調(diào)控山羊絨生長,這有助于更深入了解lncRNA在絨山羊皮膚中的功能。分析發(fā)現(xiàn)基因間lncRNA的數(shù)量最多,其他類型lncRNA較少。基因間lncRNA的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制與mRNA類似,以組織特異性的方式表達(dá)[33],比蛋白編碼基因更具組織特異性,在多種脊椎動物中都是保守的。這表明了基因間lncRNA功能的重要性。在外源褪黑素誘導(dǎo)下,有176個基因間lncRNA在絨山羊皮膚組織特異性表達(dá),提示其可能以保守穩(wěn)定地方式參與調(diào)控山羊絨生長。

同為研究褪黑素介導(dǎo)mRNA和lncRNA對山羊絨生長的影響,Ge等[34]利用STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥string-db.org)分析mRNA和lncRNA的相互作用網(wǎng)絡(luò),STRING數(shù)據(jù)庫基于文獻(xiàn)研究報道的試驗驗證的直接物理互作或生物信息學(xué)方法推斷的間接功能相關(guān)來檢索基因間可能的相互作用,本研究使用WGCNA分析方法基于基因的加權(quán)相關(guān)系數(shù),將具有相似表達(dá)模式的基因歸為同一個模塊,為研究mRNA和lncRNA之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系提供了新途徑,相似表達(dá)模式的基因在功能上具有相關(guān)性,這有助于挖掘山羊產(chǎn)絨這一復(fù)雜性狀相關(guān)的弱效應(yīng)mRNA和lncRNA,也為注釋家畜lncRNA提供了新思路。Zhang等[20]和Watt等[35]提出Hippo信號通路調(diào)節(jié)哺乳動物毛囊形態(tài)發(fā)生、器官大小和發(fā)育,Federica等[21]提出Hippo信號通路和褪黑素信號存在串?dāng)_,本研究結(jié)果證明了褪黑素和Hippo信號通路間存在互作,推測褪黑素可能通過Hippo信號通路調(diào)節(jié)絨山羊皮膚次級毛囊的大小和發(fā)育,從而調(diào)控羊絨在非生絨期的生長。山羊絨生長的生物學(xué)過程和調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)如此復(fù)雜,傳統(tǒng)的基因表達(dá)分析策略側(cè)重于識別在兩種生物學(xué)狀態(tài)之間表現(xiàn)出差異的單個基因,無法檢測到代謝途徑、轉(zhuǎn)錄程序和應(yīng)激反應(yīng)等生物過程,本研究使用GSEA在基因集的水平上分析調(diào)控山羊絨生長的候選數(shù)據(jù),考慮檢測到的基因數(shù)量、它們的相對排名和注釋到感興趣通路的基因數(shù)量,統(tǒng)計檢驗顯著差異的通路,將大的候選基因列表總結(jié)為一個較小的更容易解釋的通路列表[36]。而不是僅考慮那些變化倍數(shù)或顯著性高于臨界值的基因,保留了基因間相關(guān)性,提供了更準(zhǔn)確的模型,有助于將先驗知識與新生成的數(shù)據(jù)聯(lián)系起來,發(fā)現(xiàn)基因型與表型的關(guān)系,揭示正常生理狀態(tài)下和外源褪黑素誘導(dǎo)下基因的集體行為,驗證了候選基因集調(diào)控山羊絨生長的功能。屬于同一基因集或通路的基因更可能以協(xié)調(diào)的方式表達(dá),并表現(xiàn)出一定程度的相關(guān)性。包含相關(guān)基因的基因集更一致,會比不一致、不相關(guān)的基因集提供更高的生物信號。候選基因集在正常生理狀態(tài)下和外源褪黑素誘導(dǎo)下與樣本的關(guān)聯(lián)結(jié)果與山羊絨生長周期一致,同樣驗證了候選基因集調(diào)控山羊絨生長的功能。在候選基因集里發(fā)現(xiàn)了16個已經(jīng)被報道的毛囊發(fā)育和絨毛生長的調(diào)節(jié)因子:FZD1、FZD7、FZD10、TCF7L2[37],WNT11、WNT2B[38]、LEF1[39]、FGFR2[40]、BMP2、BMP4[41]、FOXN1[42]、HOXC13[43]、SOX9[44]、GPRC5D、PRR9、LRRC15[45],其中TCF7L2、LEF1、FOXN1、HOXC13和SOX9是轉(zhuǎn)錄因子,FGFR2是轉(zhuǎn)錄輔因子,LEF1、GPRC5D、LRRC15、FOXN1、HOXC13和WNT11是核心基因,這也證實了分析方法的可靠性。基因?qū)ι镞z傳性狀的控制具有時間和空間復(fù)雜性,在生命體內(nèi)生物學(xué)通路之間存在相互作用的復(fù)雜關(guān)系網(wǎng),而探索褪黑素促絨生長的更多基因、更多pathway依賴于研究技術(shù)和研究方法的不斷創(chuàng)新與完善。

4 結(jié) 論

本研究篩選在褪黑素影響下全年每月絨山羊皮膚組織樣本共得到2 024個DE-mRNA和329個DE-lncRNA,從轉(zhuǎn)錄組水平對絨山羊特有的產(chǎn)絨性狀,在基因集層面揭示了在外源褪黑素誘導(dǎo)下,Hippo信號通路調(diào)控山羊絨生長的關(guān)鍵lncRNA及mRNA和lncRNA多基因之間的互作關(guān)系,從2個不同角度透視了候選基因集調(diào)控山羊絨生長的生物學(xué)功能,為進(jìn)一步研究外源褪黑素促山羊絨生長的機(jī)制提供了參考。