口腔扁平苔蘚組織中IL-35 表達水平與外周血CD4+CD25+Treg 的相關性

劉婷婷，劉冰，楊利杰

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔內科，河南 鄭州 450002）

扁平苔蘚是由不明原因引起的累及黏膜、毛囊、皮膚等慢性炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為紫紅色、多角形扁平丘疹和斑塊，大多分布于手腕、前臂、頸部和遠端下肢[1]。分布于黏膜上的扁平苔蘚多為口腔扁平苔蘚（Oral lichen planus，OLP），主要表現(xiàn)為口腔內舌部、唇部、牙齦和顎部刺痛[2]，不僅影響口腔部位，還伴有皮膚以及甲部病損，長期病損有惡變現(xiàn)象，但幾率較低，僅為0%～2%左右[3]。依據(jù)病損處黏膜狀況可將OLP 分為糜爛性和非糜爛性兩大類，糜爛性多表現(xiàn)為白色糜爛狀黏膜，偶見充血。非糜爛型指病損處未出現(xiàn)充血及糜爛，一般為白色水皰、斑塊及條紋樣[4]。目前廣泛認為免疫因素與OLP 的發(fā)病有關，其中又以T 淋巴細胞免疫反應為主[5]。CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞（Regulatory T cells，Treg）是T 淋巴細胞亞群重要之一，CD4+CD25+Treg 細胞可占CD4+T 淋巴細胞的5%～10%左右[6]，在維持自身免疫耐受中發(fā)揮關鍵作用，參與自身及外來抗原介導的細胞免疫應答反應。叉狀頭轉錄因子P3 （Forkhead box P3，F(xiàn)OXP3）是Treg 細胞的標志基因，也是CD4+CD25+Treg 細胞生長和發(fā)育的重要轉錄調控因子，可作為CD4+CD25+Treg 細胞的特異性標志物。白介素-35（Interleukin35，IL-35）是近些來年新發(fā)現(xiàn)的白介素-12（Interleukin12，IL-12）家族中的一員，由IL-12 p35和EB 病毒誘導蛋白3（Epstein-Barr virus-induced gene3，EBI3）組成，通過調控Treg 細胞、輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）細胞分化和TH17/Treg 平衡，影響免疫反應[7]。本次實驗探究OLP 患者組織內IL-35 和CD4+CD25+Treg 水平的變化，并分析其與OLP 發(fā)病的關系。

1 方法

1.1 一般資料 收集2016 年9 月至2018 年9 月期間我院口腔科收治的口腔扁平苔蘚患者38 例，設為OLP 組，其中男性患者10 例，女性28 例，年齡為18～68 歲，平均年齡為（45.12±11.38）歲，其中糜爛型OLP 患者13 例，非糜爛型OLP 患者25例。另選同期來我院體檢的健康人群20 例作為對照組，男性7 例，女性13 例，年齡為19～66 歲，平均年齡為（46.05±12.11）歲。對比OLP 組和對照組人群性別、年齡等基礎資料，無統(tǒng)計學差異，兩組數(shù)據(jù)具有可比性。

1.2 納入排除標準 納入標準：OLP 組患者均符合口腔扁平苔蘚診斷標準[8]，并結合臨床癥狀及病理活檢后確診；入院前未接受過任何OLP 治療方案；OLP 組和對照組年齡均為18 歲以上，臨床資料完善，自愿參與本次研究者。

排除標準：口腔修復材料及藥物等引起的苔蘚樣皮疹；患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者；患有牙周炎、口腔白斑等其他口腔疾病；30天內接受過抗生素及免疫治療者；患有高血壓、糖尿病等基礎疾病者；18 歲以下未成年者；臨床資料不全，不愿參與本次研究者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 抽取OLP 患者及健康對照者晨起空腹外周靜脈血各10 mL，將其中5 mL 置于含有EDTA 的抗凝管中，輕搖試管充分混合，采用離心機 （廠家：上海能共實業(yè)有限公司；規(guī)格：BXTGL16M）以3 000 rpm 轉速將血液樣本高速離心10 min，使其分為血漿層（上層）和紅細胞層（下層），小心吸去上層血漿，待酶聯(lián)免疫吸附試驗時檢測炎癥因子的含量。以生理鹽水稀釋下層紅細胞，將稀釋后紅細胞按1:1 比例加入淋巴細胞分離液中，注意不破壞分界層，按照淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque（廠家：美景生物科技有限公司；貨號：IAE-1）說明操作進行，離心機以1 800 rpm 轉速4℃下高速離心20 min，當觀察到試管中呈現(xiàn)明顯的4 層結構時，小心吸取第二層（即白膜層）中的外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs），并向含有PBMCs 細胞的試管中加入生理鹽水重懸，保存至-40℃條件下，待后續(xù)熒光定量PCR 檢測細胞中mRNA 的表達。另外5 mL全血進行CD4+CD25+Treg 細胞的檢測。此外，分別收集OLP 患者口腔扁平苔蘚組織標本和健康對照者正常口腔上皮黏膜標本，10%福爾馬林固定后進行免疫組織化學檢測。

1.3.2 熒光定量PCR 采用Trizol 試劑 （上海邦景實業(yè)有限公司）提取PBMCs 細胞中的總RNA，取2 μL 總RNA，與隨機引物、三磷酸脫氧核糖核苷、Rnase-free 水各1 μL 充分混合后，PCR 儀孵育，再與第一緩沖區(qū)4 μL、M-MLV 反轉錄酶1 μL、RNA酶抑制劑1 μL 混勻后45℃下孵育50 min，70℃下孵育5 min，將總RNA 逆轉錄成cDNA。2%瓊脂糖凝膠110 V 凝膠電泳30 min，與SGYR super Mix、上下游引物、雙蒸餾水、熒光定量PCR 參比染料（北京百奧萊博科技有限公司）95℃預變性3 min。94℃反應30 s，61℃反應30 s，72℃反應60 s，共循環(huán)40 次，采用MA-6000 熒光定量PCR 儀（濟南泰醫(yī)生物技術有限公司）按照2-ΔΔCt方法[9]分析以GAPDH 作為內參時EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的相對mRNA 表達，上下游具體引物設計，見表1。

表1 上下游引物序列

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測OLP 患者和健康者經高速離心后上層血漿中IL-35、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白介素-17（Interleukin-17，IL-17）和轉化生長因子β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）的含量，將提取的各組血清從-40℃條件下取出并稀釋，分別以IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 試劑盒（均購自卡上海邁舒生物科技有限公司）按照說明書操作檢測各組患者血清炎癥因子水平。

1.3.4 流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+Treg 細胞水平 取5 mL 健康者和OLP 患者全血，分別加入熒光PE 標記的CD4 和FITC 標記的CD25 抗體，以γ1、γ2 作為陰性對照，均在室溫條件下共同培養(yǎng)30 min，再以紅細胞裂解液進行裂解，緩沖液多次洗滌后高速離心，棄上清液，將細胞懸液重懸于緩沖液中，采用流式細胞儀（廠家為上海寰熙醫(yī)療器械有限公司；型號為BriCyte E6）檢測CD4+T 細胞和CD4+CD25+Treg 細胞水平。

1.4 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學處理用SPSS 22.0 進行，計量資料采用（±s）表示，t 檢驗。計數(shù)資料率用（n，%）表示χ2檢驗。采用Pearson 法進行相關性分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mR-NA 表達 熒光定量PCR 檢測OLP 組和對照組PBMCs 細胞中EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，OLP 組EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mRNA 均顯著上調（P<0.05），見圖1。

圖1 EBI3、IL-12 p35、FOXP3 的mRNA 表達

2.2 血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的水平 與對照組相比，OLP 組患者血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 含量顯著均上調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

表2 血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的含量（±s）

表2 血清IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的含量（±s）

組別IL-35（pg/mL）IL-10（pg/mL）IL17（pg/mL）TGF-β1（ng/mL）對照組（n=20）OLP 組（n=38）tP 163.21±52.43 197.62±61.22 2.133 0.037 129.24±21.41 318.46±25.87 28.016＜0.001 190.23±48.76 287.64±62.17 6.083＜0.001 37.84±13.97 49.23±17.25 2.543 0.014

2.3 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細胞水平 與對照組相比，OLP 組患者外周血CD4+T 細胞和CD4+CD25+Treg 細胞水平均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表3。

表3 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細胞水平（±s，%）

表3 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細胞水平（±s，%）

組別CD4+CD25+TregCD4+T對照組（n=20）OLP 組（n=38）χ2P 7.94±1.22 2.36±0.64 22.935＜0.001 36.85±4.72 21.03±5.11 11.497＜0.001

2.4 組織IL-35 和外周血CD4+CD25+Treg 與OLP患者臨床病理特征的關系 IL-35 和CD4+CD25+Treg 水平與患者基底細胞變性程度有關（P<0.05），而與性別、年齡、病程、疾病類型和淋巴細胞浸潤無關（P>0.05），見表4。

表4 組織IL-35 和外周血CD4+CD25+Treg 與OLP 患者臨床病理特征的關系（±s）

表4 組織IL-35 和外周血CD4+CD25+Treg 與OLP 患者臨床病理特征的關系（±s）

臨床資料因素nIL-35（pg/mL）tP性別男女10 28 195.67±60.28 198.95±64.23 0.128 0.899 CD4+CD25+Treg（%）2.11±0.61 2.45±0.52 t 1.697 P 0.098年齡病程疾病類型淋巴細胞浸潤程度基底細胞變性程度＞40 歲≤40 歲＞6 個月≤6 個月糜爛型非糜爛型1 分2 分3 分1 分2 分3 分16 22 18 20 13 25 7 16 15 16 18 4 186.47±53.92 205.62±61.08 183.62±67.85 209.92±70.28 211.35±68.74 190.43±75.26 170.08±75.31 189.34±63.28 219.81±68.95 181.91±42.49 195.24±70.82 271.26±62.71 1.001 1.171 0.836 1.502 3.629 0.323 0.249 0.409 0.237 0.037 2.30±0.63 2.41±0.58 2.32±0.59 2.39±0.48 2.41±0.63 2.34±0.57 2.40±0.45 2.38±0.51 2.32±0.48 2.59±0.42 2.25±0.54 1.94±0.30 0.557 0.403 0.347 0.087 3.934 0.581 0.689 0.731 0.917 0.029

2.5 IL-35 與CD4+CD25+Treg 相關性分析 對OLP患者口腔扁平苔蘚組織IL-35 與外周血CD4+CD25+Treg 水平進行相關性分析，IL-35 與CD4+CD25+Treg 的水平呈正相關（r=0.3644，P<0.05），見圖2。

圖2 IL-35 與CD4+CD25+Treg 相關性分析

3 討論

口腔扁平苔蘚是多發(fā)于中老年女性的慢性炎癥性口腔黏膜疾病，多見于口腔黏膜、舌部和牙齦部位，且口腔病變始終呈雙側對稱分布[11]。過往研究指出，OLP 還是一種T 淋巴細胞功能障礙引起的局限性自身免疫性疾病，雖不具備傳染性，但存在惡性病變可能[12]。現(xiàn)階段多通過檢測患者自身抗體、血清同型半胱氨酸水平對患者進行病情評估[13]，由于OLP 是免疫介導的疾病，臨床治療方式以皮質類固醇為主。CD4+CD25+Treg 細胞是T 淋巴細胞重要亞群之一，負責調控自身免疫反應，參與紅斑狼瘡等自身性免疫疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg 細胞和IL-35 在OLP 患者外周血和黏膜組織中異常表達，且與臨床病理特征有關。

IL-35 是IL-12 超家族的一員，具有調控調節(jié)性B 細胞（Breg）和調節(jié)性T 細胞（Treg）分化的作用，通過抑制淋巴T 細胞增殖和Breg 細胞產生IgE 抗體，誘導Th2 細胞因子的產生，發(fā)揮免疫抑制活性。最新的研究已經證實，Treg 細胞可分泌IL-35，并通過IL-35 的兩個重要亞基IL-12 p35和EBI3 的合成與釋放，參與機體免疫反應，在銀屑病、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫疾病中發(fā)揮重要的免疫抑制作用[15]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，IL-35 的亞基IL-12 p35 和EBI3 在OLP 患者外周血單個核細胞和口腔黏膜組織中的表達均顯著高于正常人群。推測原因可能與OLP 患者發(fā)病時機體免疫耐受平衡被打破有關，Treg 細胞增多但伴有功能缺陷和受損，釋放更多的IL-10、TGF-β1、IL-35 等細胞因子的來彌補功能缺陷導致的免疫抑制作用下降[16]。本次研究結果還顯示，口腔扁平苔蘚癬組織中IL-35 水平與患者基底細胞變形程度有關，隨著OLP患者病情的進展，基底細胞變形程度逐漸加劇，IL-35 水平顯著增強，以補償和維持免疫抑制效應。

Treg 細胞主要由CD4+CD25+Treg 細胞、Trl 細胞和Th3 細胞等組成，其中CD4+CD25+Treg 細胞被認為是與免疫反應激活有關的重要亞群，參與調控腫瘤免疫、移植免疫和感染性免疫等免疫應答[17]。FOXP3 是CD4+CD25+Treg 細胞的特異性標記分子，不僅可調控T 淋巴細胞增殖和分化，同時也是Treg 發(fā)揮其免疫抑制活性的關鍵因子。IL-10、IL17和TGF-β1 是反映炎癥程度的關鍵指標，其含量越高，代表炎癥反應被激活，機體炎癥水平越高。本次研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg 細胞的特異性標志物FOXP3 在OLP 患者組織和外周血中表達均顯著上調，與對照組相比，口腔扁平苔蘚患者外周血CD4+CD25+Treg 水平顯著降低，且其水平的變化與患者基底細胞變形程度有關。這表明OLP 患者體內存在明顯的Th17/Theg 免疫失衡，Th17 細胞分泌大量的IL17，結合其受體活化核因子-κB 等信號通路、加速IL-10、TGF-β1 等炎癥因子的分泌和釋放[18]，引起炎癥反應。因此，CD4+CD25+Treg 細胞參與了OLP 的病情進展過程，介導炎癥進程，增強Theg 免疫抑制活性，維持Th17/Theg 免疫穩(wěn)態(tài)平衡。

通過對OLP 組織內IL-35 和CD4+CD25+Treg細胞水平進行檢測，分析其在OLP 患者體內表達的相關性，結果發(fā)現(xiàn)，IL-35 與CD4+CD25+Treg 的水平呈正相關（r=0.3644，P<0.05）。FOXP3 是Treg細胞發(fā)揮免疫抑制作用必不可少的分子，而IL-35的重要亞基EBI3 被證實是FOXP3 的下游靶點之一[19]，IL-35 也同樣僅表達于Treg 細胞中，二者共同作用誘導CD4+CD25+Treg 發(fā)揮免疫抑制作用，IL-35 和CD4+CD25+Treg 均在OLP 患者體內發(fā)揮促炎作用[20]，激活炎癥反應，加速炎癥介質IL-35、IL-10、IL17、TGF-β1 的釋放，引起OLP 疾病進展[21]，因此，IL-35 和CD4+CD25+Treg 在OLP 患者體內呈正相關關系。

綜上所述，IL-35 和CD4+CD25+Treg 均在OLP患者中高表達，激活炎癥反應和免疫抑制效應，二者呈明顯正相關，其表達水平的上調也與患者病情進展有關，提示OLP 患者體內存在免疫失衡，IL-35 和CD4+CD25+Treg 異常表達參與了OLP 發(fā)生發(fā)展，為臨床治療OLP 提供了更多理論依據(jù)。