CMKLR1 三種檢測方法在宮頸癌中的表達及臨床意義

孫海芹，程希花，王彥紅

（1.鶴壁市婦幼保健院婦女保健科；2.婦產科；3.檢驗科，河南 鶴壁 458030）

宮頸癌是全球女性最常見惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均較高，且具有一定地域差異性，以發展中國家最為多見，而我國是一個人口大國，占比較大[1]。隨著科技不斷進步，宮頸癌早期篩查、診斷及預防不斷普及，大部分國家死亡率整體下降，而我國則未見明顯改善，甚至有上升趨勢，認為與宮頸癌危險暴露因素增加有關[2]。個體性行為是其關鍵危險因素，女性首次性行為年齡提前，性行為次數及伴侶增加，越來越多年輕女性存在慢性宮頸炎和宮頸鱗狀上皮內病變，最終部分可發展為宮頸癌，影響生活質量，威脅其生命[3]。目前，腫瘤研究多涉及微觀領域，科研工作者力求從分子水平完成腫瘤的診斷、治療及預后評估；近年研究發現趨化因子及趨化因子受體不僅可在大部分腫瘤細胞中廣泛表達，還可參與其增殖、轉移及侵襲等[4-5]。但關于趨化因子受體1(Chemokine receptor-like 1，CMKLR1)與宮頸癌的研究報道較少。本研究采用實時熒光PCR （Real-time fluorescent polymerase chain reaction，RT-FPCR）、免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）和酶聯免疫吸附法（EnzymeLinked Immunosor-bent Assay,ELISA）檢測CMKLR1 在宮頸癌、宮頸鱗狀上皮內病變和慢性宮頸炎中的表達差異，并分析其與宮頸癌臨床特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015 年2 月至2018 年2 月鶴壁市婦幼保健院收治的125 例宮頸癌患者、92例宮頸鱗狀上皮內病變患者和66 例慢性宮頸炎患者作為研究對象，分別命名為宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內病變組和宮頸炎組，同期選取40 例健康女性作為對照組。納入標準:宮頸癌（1）臨床表現、實驗室及病理結果均證實為宮頸癌者，且FIGO 分期在I-III 間者；（2）均行手術治療且預期生存期>3月者；（3）臨床及隨訪資料完整者；（4）排除合并其它惡性腫瘤者；（5）排除非腫瘤原因死亡者；宮頸鱗狀上皮內病變（1）陰道鏡及病理結果提示為宮頸鱗狀上皮內病變者；（2）排除合并其它惡性腫瘤者；慢性宮頸炎（1）臨床表現、實驗室檢查及陰道鏡檢查均提示為慢性宮頸炎者；（2）排除合并宮頸鱗狀上皮內病變和或宮頸癌者。4 組受試者年齡比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，且通過鶴壁市婦幼保健院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 采用RT-FPCR 檢測CMKLR1 mRNA 手術切下癌組織和癌旁正常組織于30 min 內置于RNA 保存液中，-80℃冰箱保存待檢測：待集齊后進行RT-FPCR 檢測。第一，總RNA 提取和cDNA制備，參照CMKLR1 RNA 提取和逆轉錄試劑盒說明書完成檢測；第二，RT-FPCR 檢測，用Pubmed中BLAST 軟件設計CMKLR1 引物，其中內參基因是GAPDH，配置PCR 擴增體系（20 μL），設置擴增條件后上機進行檢測，并計算CMKLR1 mRNA 相對表達水平。其中QuantStudio5 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司，試劑盒均購自美國Sigma 公司。

1.2.2 采用IHC 檢測組織CMKLR1 蛋白 取病理科石蠟塊進行切片、脫蠟及抗原修復后加入CMKLR1 單克隆抗體（1:300），4℃過夜，第2 d，緩沖液洗3 次，后加入二抗，室溫孵育30 min （避光）；后經二氨基聯苯胺（DAB）染色、蘇木精復染、脫水、透明及封片后閱片。本研究采用雙盲閱片法，統一閱片標準后由兩位高年資質病理醫師完成。其中CMKLR1 單克隆抗體購自美國Abcam 公司，產品批號為201905。

結果判定：CMKLR1 蛋白主要位于細胞質，腫瘤細胞胞質中出現棕黃色或黃色顆粒則認定為陽性細胞，根據陽性細胞百分率不同記為：無陽性細胞0 分；≤10% 1 分；11%～49% 2 分；≥50% 3 分。根據著色強度不同記為：無著色0 分；淡黃色1分；黃色2 分；棕褐色3 分。兩者乘積計分：陽性為≥4 分者；陰性為0～3 分者。

1.2.3 采用ELISA 檢測血清CMKLR1 收集所有研究對象入組第1 d 空腹外周血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清于液氮快速凍存后轉移至-80℃冰箱保存待用；待所有標本集齊后參照血清CMKLR1-ELISA 檢測試劑盒說明書完成檢測，于波長450 nm 酶標儀上讀取OD 值，繪制曲線獲取CMKLR1 濃度。其中試劑盒購自上海酶聯免疫生物有限公司，產品批號為201912。

1.3 隨訪 對宮頸癌患者隨訪3 年，截止日期為2021 年2 月1 日，無因其它原因中途退出者，記錄其總生存期 (Overall Survival,OS) 和無病生存期(Disease-free survival,DFS)。

1.4 統計學方法 本研究所有數據均采用SPSS20.0 統計學軟件進行分析，其中計量資料用（±s）描述，2 組間比較采用t 檢驗，2 組以上比較采用單因素方差分析；計數資料用構成比描述，用χ2檢驗進行比較；采用Kaplan-Meier 法和Logrank 法進行生存分析；用Pearson 相關分析血清CMKLR1 與組織CMKLR1 mRNA 和CMKLR1 蛋白的關系；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組CMKLR1 mRNA 比較 宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內病變組和宮頸炎組3 組組織中CMKLR1 mRNA 比較，差異有統計學意義（P＜0.05），且表現為宮頸癌組＞宮頸鱗狀上皮內病變組＞宮頸炎組。見表1。

表1 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

表1 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

注：與宮頸炎組比較，at=20.889,aP=0.000；與宮頸鱗狀上皮內病變組比較，bt=21.949,bP=0.000。

組別n宮頸癌組宮頸鱗狀上皮內病變組宮頸炎組125 92 66 FP CMKLR1 mRNA 5.951.03b 3.340.57a 1.850.12 14.492 0.001

2.2 宮頸癌組癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 比較 與癌旁正常組織比較，宮頸癌組癌組織CMKLR1 mRNA 和CMKLR1 蛋白陽性率均明顯升高，且差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 蛋白免疫組化圖

表2 宮頸癌組癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 比較（%,±s）

表2 宮頸癌組癌組織和癌旁正常組織CMKLR1 比較（%,±s）

類別n CMKLR1 蛋白陽性陰性癌組織癌旁正常組織125 125 80（64.00）24（19.20）45（36.00）101（80.80）trP CMKLR1 mRNA 5.951.03 1.240.22 44.998 0.000 51.633 0.000

2.3 CMKLR1 蛋白與宮頸癌臨床特征的相關性CMKLR1 蛋白在FIGO 分期、肌層浸潤和淋巴轉移上差異表達，且有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 CMKLR1 蛋白與宮頸癌臨床特征的相關性

2.4 CMKLR1 蛋白與宮頸癌預后的關系 經3 年隨訪，CMKLR1 蛋白陽性表達者OS 生存率（29/80）和DFS 生存率（26/80）明顯低于陰性表達者[（30/45）和 （27/45）]（r=10.692，P=0.001；r=8.918，P=0.003）。見圖2。

圖2 CMKLR1 蛋白與宮頸癌預后的關系

2.5 4 組血清CMKLR1 比較 宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內病變組、宮頸炎組和對照組4 組血清CMKLR1 比較，差異有統計學意義（P<0.05），且表現為宮頸癌組>宮頸鱗狀上皮內病變組>宮頸炎組>對照組。見表4。

表4 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

表4 3 組CMKLR1 mRNA 比較（±s）

注：對照組與宮頸炎組比較，aP<0.05；宮頸炎組與宮頸鱗狀上皮內病變組比較，bP<0.05；宮頸鱗狀上皮內病變組與宮頸癌組比較，cP<0.05。

組別宮頸癌組宮頸鱗狀上皮內病變組宮頸炎組對照組n 125 92 66 40 FP CMKLR1（μg/L）40.25±7.63c 33.59±6.11b 28.75±5.21a 26.49±4.88 70.452 0.000

2.6 Pearson 相關分析 經Pearson 相關分析得知，血清 CMKLR1 與組織 CMKLR1 mRNA 及CMKLR1 蛋白均呈明顯正相關（P<0.05），其相關系數分別為0.471 和0.448。

3 討論

宮頸癌死亡率較高，浸潤轉移是關鍵因素，與腫瘤微環境狀態密切相關，而趨化因子及受體是腫瘤微環境重要組成成分之一，與腫瘤發生發展密切相關，已在肺癌及頭頸部鱗狀細胞癌中到證實[6-8]。CMKLR1 在1996 年被Gantz 等[9]報道，是新近重要的趨化因子受體，屬于G 蛋白偶聯受體（GPCR），但未見其配體，在白色脂肪組織和巨噬細胞等中顯著表達。有學者發現[10]，CMKLR1 是Chemerin 發揮生物學功能的主要受體，后者可趨化高表達CMKLR1 的巨噬細胞和樹突狀細胞，參與各類細胞代謝、增殖及免疫應答等生命過程中發揮重要作用。近年，越來越多研究表明[11-12]，Chemerin 可與內皮細胞膜上CMKLR1 受體結合，誘導內皮細胞增殖，促進腫瘤新生血管叢形成，在腫瘤細胞生長增殖中占有一定地位，內源性CMKLR1 可能參與子宮內膜癌進展及轉移，為子宮內膜癌臨床治療提供新的途徑。

本研究發現，CMKLR1 mRNA 水平在宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內病變組和宮頸炎組依次減少；宮頸癌組癌組織CMKLR1 蛋白陽性率明顯高于癌旁正常組織，證實CMKLR1 在宮頸癌中高表達，從基因和蛋白水平證明了CMKLR1 在宮頸癌中的“原癌基因”角色。本研究通過分析CMKLR1 蛋白與宮頸癌臨床特征的相關性發現CMKLR1 蛋白在FIGO 分期、肌層浸潤和淋巴轉移上差異表達，且FIGO 分期越高、肌層浸潤越深及存在淋巴轉移者，CMKLR1 蛋白陽性率越高，分析原因，CMKLR1 高表達可增加腫瘤新生血管叢形成速率，加快癌細胞侵襲轉移速率。此外，本研究通過Kaplan-Meier法和Log-rank 法分析CMKLR1 蛋白與宮頸癌預后的關系發現CMKLR1 蛋白陽性表達者OS 生存率（29/80）和DFS 生存率（26/80）明顯低于陰性表達者，提示CMKLR1 對宮頸癌患者預后評估的價值。盡管如此，無創檢查才是未來疾病診療的主流，血清學檢測占比較大，為此本研究還進行了宮頸癌組、宮頸鱗狀上皮內病變組、宮頸炎組和對照組的血清CMKLR1 檢測，發現血清CMKLR1 在以上組別中逐漸降低，基本與組織CMKLR1-mRNA變化吻合，為驗證此猜想本研究還進行了Pearson相關分析，發現血清CMKLR1 與組織CMKLR1 mRNA 及CMKLR1 蛋白均呈明顯正相關，說明血清CMKLR1 變化與病變組織CMKLR1 mRNA 及蛋白改變一致，提示血清CMKLR1 檢測有望替代侵入性檢查之組織mRNA+蛋白檢測，成為宮頸癌診療及預后評估的有效指標。

綜上，CMKLR1 在宮頸癌中高表達，且與FIGO 分期、肌層浸潤和淋巴轉移相關，可作為宮頸癌患者預后評估的重要指標之一。