二甲雙胍對復發性流產大鼠妊娠結局、內分泌及VEGF/MAPK信號通路的影響

周知，黎業娟，陳琳，王安國，阮海玲，馬寧，周璟，盧偉英

復發性流產（recurrent sponiaeous abortion，RSA）是育齡期女性的常見疾病［1］。正常妊娠女性自然流產發生率約10%，而RSA占5%左右［2］。RSA發病率較高且發病機制復雜，是臨床治療的難點。其與母體內分泌失調、胎盤血管網絡異常、生殖道異常、免疫功能異常、染色體異常等有關，RSA患者連續流產后再次妊娠時發生胚胎停止發育及死胎的概率會大大增加［3］。卵巢功能正常、母胎界面血管生成正常、子宮內膜完整性、母體正常的孕激素水平及相關激素受體的正常表達在受精卵的著床、妊娠的維持過程中發揮重要的作用，任一環節出現異常均有可能導致流產［4］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）直接作用于血管內皮細胞，可調節血管生成，與母胎界面血管的生成關系密切，VEGF 的正常表達對于維持孕期母體子宮及胎盤系統穩定具有重要意義。VEGF 與血管內皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）結合后可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），進而增加新生血管的生成，因此VEGF可能參與RSA過程［5-6］。研究發現，在孕早期使用二甲雙胍（metformin，Met）可增強血管內皮功能、降低流產率、改善卵巢能量代謝等［7］，但關于其對RSA 的治療效果尚不清晰。本研究通過建立大鼠RSA 模型，觀察Met 對RSA 大鼠的輔助治療作用，以期為臨床治療RSA提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠100 只、雄性SD 大鼠50只，4 月齡左右，體質量（230±30）g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2016-0002，動物質量合格證號：省科委2000A027。所購大鼠飼養于海南省婦女兒童醫學中心動物房中，適應性飼養1周后用于后續研究。本研究經本院動物倫理委員會批準后進行。

1.2 主要試劑 Met購自廣州阿達拉生物科技有限公司；黃體酮購自浙江仙琚制藥有限公司；羥基脲、米非司酮購自德國默克公司；卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、黃體生成激素（leuteinizing hormone，LH）、垂體泌乳素（prolactin，PRL）、雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone，P）放射免疫檢測試劑盒均購自北京華英生物技術研究所；VEGF、VEGFR-2兔抗鼠單抗購自Absin公司；細胞外信號調節激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）兔抗鼠單抗、GAPDH 兔抗鼠單抗、羊抗兔IgG 二抗購自英國Abcam 公司；HE 染色試劑盒購自上海生工公司。

1.3 研究方法

1.3.1 RSA 動物模型制備 RSA 大鼠模型通過改進參考文獻［8］方法進行制備：選取雌性大鼠100只、雄性大鼠50只合籠交配，于次日早晨在雌性大鼠的陰道涂片中觀察到較多精子數量及陰栓者記為受孕第1 天。選取其中受孕成功的60只雌性大鼠按照隨機數字表法分為對照組（10 只）及造模組（50 只）。造模組均持續灌胃羥基脲（450 mg/kg）10 d，第11 天灌胃米非司酮（3.75 mg/kg），羥基脲加米非司酮可成功模擬臨床流產的狀態。模型大鼠出現陰道流血、活動緩慢、精神萎靡、食欲下降等現象，解剖后大鼠子宮有竹節樣改變、子宮顏色暗紅、著床點有淤血出現等現象時即為模型構建成功，所有大鼠均造模成功。對照組灌胃等量生理鹽水，灌胃時間為每天上午7:00—8:00。

1.3.2 動物分組及給藥 將造模成功的50只大鼠按照隨機數字表法分為RSA組、黃體酮組（156 mg/kg）和Met低、中、高劑量組（250、1 000、2 000 mg/kg），每組10只，Met的給藥劑量依據參考文獻［9］和前期預實驗確定。受孕第1天開始灌胃給藥，對照組及RSA 組灌胃等量蒸餾水，灌胃時間為每天上午8:00—9:00，持續15 d。

1.3.3 大鼠胚胎丟失率觀察 末次給藥結束后24 h，即大鼠受孕第16天，將各組大鼠麻醉后處死，解剖大鼠子宮觀察胚胎丟失情況。胚胎丟失率=［流產胚胎數/（存活胚胎數+流產胚胎數）］×100%［8］。

1.3.4 大鼠血清激素水平檢測 末次給藥結束后24 h，在處死大鼠前取各組大鼠腹主動脈血3 mL，3 500 r/min離心5 min后分離血清，-20 ℃備用，按照說明書，放射免疫法檢測各組大鼠血清中FSH、LH、PRL、E2、P水平。

1.3.5 大鼠蛻膜組織病理形態學觀察 各組麻醉處死后分離大鼠子宮，用組織鉗鈍性分離子宮壁，將胚盤與胚胎剝離著床位置，無菌環境下分離大鼠子宮蛻膜組織，使用4%多聚甲醛溶液固定后，按照HE染色試劑盒說明書進行染色，檢測子宮蛻膜組織病理變化。

1.3.6 Western blot 法檢測子宮蛻膜組織VEGF/MAPK 通路相關蛋白相對表達水平 提取大鼠子宮蛻膜組織中的總蛋白，并測定其濃度，電泳后轉移至PDVF 膜上，封閉2 h后，添加VEGF、VEGFR-2、ERK、p-ERK及GAPDH一抗（1∶1 000），4 ℃過夜后TBST洗滌，加二抗（1∶5 000），孵育曝光顯色。采用蛋白成像凝膠儀分析VEGF、VEGFR-2、ERK、p-ERK 蛋白的表達水平。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 9 軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胚胎丟失率比較 對照組大鼠胚胎呈淡紅色串珠狀，存活胚胎數大于死亡胚胎數，且死亡胚胎數極少；RSA組大鼠胚胎多為褐色，胚胎部分或全部消失，子宮內出現血痕，死亡胚胎數明顯增加，存活胚胎數減少，兩者數量相當；Met各劑量組和黃體酮組與RSA 組相比，褐色胚胎減少，子宮的血痕減輕，死亡胚胎數隨著Met劑量的增加而減少，存活胚胎數隨著Met劑量的增加而增多，黃體酮組與Met高劑量組的死亡胚胎數、存活胚胎數基本一致，見圖1。與對照組比較，RSA組大鼠胚胎丟失率升高（P＜0.05）；與RSA組比較，黃體酮組胚胎丟失率下降，Met低、中及高劑量組胚胎丟失率依次下降（P＜0.05），見表1。

Fig.1 Embryo morphology of rats in each group圖1 各組大鼠胚胎形態圖

Tab.1 Comparison of embryo loss rate of rats between the six groups表1 各組大鼠胚胎丟失率比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of embryo loss rate of rats between the six groups表1 各組大鼠胚胎丟失率比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組組比較，b與RSA組比較，c與Met低劑量組比較，d與Met中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F存活胚胎數（只）56 25 31 42 49 50死亡胚胎數（只）5 30 26 19 7 10胚胎丟失率（%）8.19±1.70 54.54±8.29a 45.61±7.44b 31.14±7.30bc 12.50±2.52bcd 16.66±3.36bcd 108.271＊＊

2.2 各組血清激素水平比較 結果見表2。與對照組比較，RSA 組大鼠血清FSH、LH、PRL、E2及P 表達量均降低（P＜0.05）；與RSA組比較，Met各劑量組和黃體酮組大鼠血清FSH、LH、PRL、E2及P 表達量均升高（P＜0.05），Met 高劑量對FSH、LH、PRL、E2及P表達量的作用效果更好，但Met 高劑量組和黃體酮組各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 各組子宮蛻膜組織形態學比較 與對照組比較，RSA組大鼠子宮蛻膜組織上皮不完整、細胞排列不規則且出現萎縮變性、淤血情況明顯；與RSA組比較，Met 各劑量組大鼠的子宮蛻膜組織形態呈現不同程度的緩解，Met 高劑量組與黃體酮組的子宮蛻膜組織形態相似，見圖2。

Tab.2 Comparison of serum hormone levels of rats between the six groups表2 各組大鼠血清中激素水平比較（n=10，±s）

Tab.2 Comparison of serum hormone levels of rats between the six groups表2 各組大鼠血清中激素水平比較（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組組比較，b與RSA組比較，c與Met低劑量組比較，d與Met中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F PRL（mIU/L）102.61±5.40 70.06±2.08a 78.19±3.01b 86.37±3.71bc 96.37±4.26bcd 95.13±4.31bcd 97.383＊＊E2（ng/L）24.20±0.20 17.11±0.45a 18.71±0.12b 19.94±0.42bc 22.46±0.81bcd 21.97±0.87bcd 223.454＊＊P（μg/L）2.40±0.21 1.14±0.10a 1.57±0.14b 1.90±0.17bc 2.28±0.20bcd 2.19±0.19bcd 78.160＊＊組別對照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F FSH（IU/L）7.01±0.27 5.07±0.11a 5.71±0.13b 6.20±0.17bc 6.84±0.25bcd 6.72±0.24bcd 135.481＊＊LH（IU/L）6.03±0.75 3.09±0.39a 3.92±0.49b 4.86±0.60bc 5.83±0.72bcd 5.61±0.70bcd 35.556＊＊

Fig.2 Morphological changes of rat decidua tissue observed by HE staining(×400)圖2 HE染色觀察各組大鼠子宮蛻膜組織形態學變化（×400）

2.4 各組子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關蛋白表達比較 與對照組比較，RSA 組大鼠子宮蛻膜組織中VEGFR-2、VEGF、p-ERK 蛋白表達量均降低（P＜0.05）；與RSA組比較，Met各劑量組和黃體酮組大鼠子宮蛻膜組織中VEGFR-2、VEGF、p-ERK蛋白表達量均升高（P＜0.05），Met 高劑量對VEGFR-2、VEGF、p-ERK 蛋白表達的促進作用更好，但Met 高劑量組和黃體酮組各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表3。

Fig.3 The expression of VEGF/MAPK pathway related proteins in uterine decidua tissue of rats in each group圖3 各組大鼠子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關蛋白表達情況

Tab.3 Comparison of the expression of VEGF/MAPK pathway related proteins in uterine decidua of rats between the six groups表3 各組大鼠子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關蛋白表達情況比較 （n=10，±s）

Tab.3 Comparison of the expression of VEGF/MAPK pathway related proteins in uterine decidua of rats between the six groups表3 各組大鼠子宮蛻膜組織VEGF/MAPK通路相關蛋白表達情況比較 （n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與RSA 組比較，c與Met 低劑量組比較，d與Met中劑量組比較，P＜0.05。

組別對照組RSA組Met低劑量組Met中劑量組Met高劑量組黃體酮組F VEGFR-2/GAPDH 1.16±0.23 0.21±0.08a 0.43±0.11b 0.71±0.14bc 0.94±0.18bcd 0.91±0.17bcd 49.019＊＊VEGF/GAPDH 1.14±0.22 0.15±0.08a 0.45±0.10b 0.74±0.15bc 0.96±0.19bcd 0.93±0.16bcd 54.434＊＊p-ERK/ERK 1.18±0.04 0.40±0.02a 0.58±0.04b 0.71±0.07bc 1.05±0.09bcd 0.97±0.13bcd 161.534＊＊

3 討論

RSA 是育齡女性常見病，隨著生育人群數量增多，復發流產、自然流產率呈升高趨勢［10］。建立穩定的RSA大鼠模型對于探究流產的機制及相應治療方法具有重要的現實意義。陳陽等［11］用羥基脲和米非司酮建立流產動物模型，其中RSA 組大鼠流產率升高，血清中P 含量下降，大鼠卵巢功能受損，模型構建較為穩定。本結果亦顯示，RSA 組大鼠出現陰道流血、活動緩慢、精神萎靡、食欲下降等現象，胚胎丟失率較對照組升高，提示大鼠RSA 模型構建成功。研究顯示，Met可被小腸上皮細胞吸收，通過小腸上皮細胞膜表面的單胺轉運體及陽離子轉運蛋白轉運進入血液、肝臟、胎盤等，可增加多囊卵巢綜合征患者的妊娠率，降低流產率等［12-13］，故推測其對RSA可能具有一定的治療價值。本研究結果顯示，與RSA組比較，Met各劑量組大鼠胚胎丟失率降低，高劑量組與陽性藥物黃體酮效果相當，表明Met 尤其是高劑量具有降低RSA 大鼠胚胎丟失的作用，提示Met可改善RSA 臨床癥狀，但關于其具體作用機制尚不明確。

女性生殖功能的內分泌穩態通過下丘腦-垂體-卵巢軸調節，女性正常的激素水平對于維持妊娠具有重要意義［14］。FSH 是由垂體分泌的一種糖蛋白，具有促進卵巢生長及卵泡顆粒層細胞增殖分化的作用；LH 是一種促性腺激素，促進機體排卵及生成黃體；PRL水平過高或過低均會影響卵泡的成熟；E2是由卵巢分泌的一種性激素，血清E2的水平能反映胎兒的生長狀況及胎盤的狀態，低水平的E2不利于胎兒的正常生長發育，可能預示著不良妊娠結局；P 是由卵巢黃體分泌的一種孕激素，對于維持妊娠具有重要作用［15-16］。本研究結果顯示，與RSA 組比較，Met 各劑量組大鼠血清FSH、LH、PRL、E2及P 表達量均升高，高劑量Met與黃體酮調節RS大鼠內分泌作用效果差異無統計學意義，提示Met 尤其高劑量組具有調節RSA 大鼠內分泌的作用，考慮Met 緩解RSA大鼠胚胎丟失情況可能與改善大鼠內分泌功能有關。

妊娠過程中豐富的營養及血液供應是維持胚胎正常發育的關鍵因素，子宮蛻膜組織健康的血管網絡及血液循環發揮著重要作用。VEGF 具有改善血管通透性、促進血管內皮細胞有絲分裂、誘導血管形成等作用，通過與其受體VEGFR-2 結合發揮作用，對母胎界面的血管網絡及血管生成起到積極作用，低表達的VEGF 可導致絨毛血管網絡生成不足、血管內皮細胞分裂異常等，進而引發流產［17］。ERK 是MAPK的家族成員，是MAPK主要的信號傳導途徑，VEGF 與其受體VEGFR-2 結合后可促進ERK 的激活，ERK激活后可將信息轉導入細胞核，對細胞的分化及胚胎的發育具有一定的調控作用，能促進血管內皮細胞的增殖，對母胎界面的血管生成具有促進作用［18-19］。研究發現，小鼠胚胎丟失率高、蛻膜組織血管新生均與VEGF/MAPK 通路相關蛋白表達異常有關［20-21］。本研究結果顯示，與RSA 組比較，Met 各劑量組大鼠子宮蛻膜組織血管損傷得到一定的緩解，子宮蛻膜組織中VEGFR-2、VEGF、p-ERK 蛋白表達量均升高，且高劑量Met 的效果更佳，表明Met對RSA大鼠的子宮蛻膜組織血管具有一定的保護作用，可提高VEGF/MAPK通路相關蛋白的表達。

綜上所述，Met 具有降低RSA 大鼠的胚胎丟失率、調節內分泌等作用，可能與Met 具有促進VEGF/MAPK 通路激活作用有關。然而，本研究只是初步探究Met 對RSA 大鼠內分泌及VEGF/MAPK 通路的影響，未進行相關通路抑制劑及激活劑的驗證實驗，后續仍需深入研究。