骨髓間充質干細胞治療激素性股骨頭壞死的研究進展

錢士達，于雪峰

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是臨床中使用大劑量類固醇激素治療腎病綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病時常見的并發(fā)癥［1］，是一種退行性骨病，可導致股骨頭塌陷，進而損傷髖關節(jié)，且此過程難以逆轉，嚴重影響患者的生活質量［2］。研究普遍認為，骨結構的損傷和宏觀力學性能的改變是導致股骨頭坍塌的原因，而這源于骨修復過程中成骨活動和破骨活動的不平衡［3］。針對SONFH 的治療方法，無論是以全髖關節(jié)置換術（total hip arthroplasty，THA）為代表的關節(jié)置換手術治療，還是以髓芯減壓（core decompression，CD）為代表的保髖治療，均不能有效增強骨修復及防止生物力學坍塌［4］。若可維持成骨活動和破骨活動之間的平衡，延遲股骨頭壞死和塌陷，即可修復SONFH。目前干細胞移植結合組織工程技術在醫(yī)學領域引起了廣泛的關注。有研究顯示，合理應用干細胞移植技術可減緩SONFH 進展，提高Harris 髖關節(jié)評分，甚至逆轉 疾 病 分 期［5-6］。 骨 髓 間 充 質 干 細 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是具有多向分化潛能的多功能干細胞，為成骨細胞的最主要來源，在骨組織的修復過程中起著重要的作用［7］。本文主要從BMSCs的性質、SONFH的臨床診療進展及BMSCs 治療SONFH 的實驗研究3 個方面對BMSCs治療SONFH的研究進展進行綜述。

1 BMSCs及其分子機制

BMSCs 首次在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，是一種梭形、貼壁的非造血干細胞，占骨髓內有核細胞的0.001%~0.010%［8］。BMSCs具有獲取方便、免疫原性較低等優(yōu)點［9］。BMSCs具有多向分化潛能，可分化成各種中胚層譜系，包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和造血支持基質等［10］。在宏觀層面上，BMSCs的分化方向受到運動［11］、年齡［12］和類固醇激素使用［13］等多種因素的影響，且隨著年齡增加或類固醇激素長期應用，BMSCs傾向于成脂分化而非成骨分化。在微觀層面上，BMSCs的分化方向亦受轉化生長因子-β（TGF-β）/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Wnt、Notch 等多種信號通路及相關生物因子的影響［8，14］。

（1）TGF-β/BMP 通路。TGF-β可抑制包括上皮細胞、內皮細胞、血細胞在內的多種類型細胞的增殖。BMP是TGF-β配體家族最大的分支，在調節(jié)BMSCs的成脂和成骨分化中具有雙重作用［15］。BMP2 單獨使用可以促進BMSCs 的增殖和成骨分化，與過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）聯(lián)用時，則可促進BMSCs的成脂分化［16］。（2）Wnt通路。Wnt蛋白是一個富含半胱氨酸的分泌型脂糖蛋白家族，包括至少19種不同的分泌蛋白，在多種病理生理活動中發(fā)揮著重要作用。從根本上來說，Wnt是生長刺激因子，可促進細胞增殖，即可促進BMSCs成骨分化，抑制其成脂分化［17］。（3）Notch 通路。在人體發(fā)育過程中，Notch 通路介導大多數(shù)生物體內保守的細胞信號傳導，尤其是在內皮細胞中促進血管生成。也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch 通路可以降低BMSCs 的增殖活性，促進其成骨分化［14，18］。Smad 蛋白和基質細胞衍生因子-1α（stromal cellderived factor 1 alpha，SDF-1α）等細胞因子也可通過上述信號通路參與BMSCs的分化調節(jié)［8，19］。

BMSCs的增殖能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸降低，但是其成骨能力在傳代過程中相對保守，且可以通過低溫維持其增殖能力［20］。BMSCs 不僅能通過自身增殖分化直接替代骨組織，還能夠通過旁分泌促進組織的修復。Lu 等［7］選用C57BL/6J 小鼠為實驗動物，治療組使用負載miR-29a 的BMSCs外泌體，對照組則使用無負載miR-29a的BMSCs外泌體，均通過尾靜脈注射；2個月后，收集股骨，通過免疫染色和Micro-CT 分析骨生成，結果顯示，治療組小鼠股骨表面骨鈣蛋白陽性的成骨細胞數(shù)量及骨小梁厚度均高于對照組。

2 SONFH的臨床診療進展

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）可分為國際骨循環(huán)研究協(xié)會（Association Research Circulation Osseous，ARCO）Ⅰ—Ⅳ期，其中Ⅰ期和Ⅱ期ONFH 還未出現(xiàn)軟骨下骨折或股骨頭塌陷，可以采用保守治療；Ⅲ期和Ⅳ期時已出現(xiàn)股骨頭塌陷和關節(jié)破壞。一旦出現(xiàn)股骨頭塌陷，THA 是目前唯一可以恢復關節(jié)功能的治療方式［21］。但是置換的關節(jié)存在時間限制，不能作為年輕患者的最佳選擇［22］；且感染、脫位、再次手術等相關并發(fā)癥均會影響THA 的治療效果；ONFH 亦是THA 手術失敗的危險因素［23］。截骨術（Osteotomy，OT）和CD 是治療早期ONFH 常用的方法，其中OT 主要有經轉子內翻截骨術（Transtrochanteric curved varus osteotomy，TCVO）和經轉子旋轉截骨術（transtrochanteric rotational osteotomy，TRO）兩種術式，目的是將壞死區(qū)域從股骨頭的負重面移開；但在以往的報告中兩種術式的成功率為17%~100%，參差不齊，僅在亞洲少數(shù)國家使用［24］；而CD 則是通過去除壞死部分以降低骨內壓，同時改善靜脈回流和血液循環(huán)，從而加強骨組織再生，減輕髖關節(jié)疼痛［6］。在CD后會形成空腔，自體骨、骨髓濃縮物、成骨細胞、BMSCs 等多種生物活性物質可應用于CD 后的空腔植入，并取得了一定的效 果［6，25-26］。在CD 空 腔 中 植 入 干 細 胞 也 是 干 細 胞 治 療SONFH最主要的途徑。

在CD 空腔中植入干細胞治療SONFH 的方法在1993 年由Hernigou 和Beaujean 首次提出，但并未大范圍應用于臨床，多數(shù)患者仍選擇手術治療［27］。近年來，隨著研究的深入，BMSCs 不僅應用于臨床治療SONFH，更成為克羅恩病、乳腺癌等疾病的治療方案［28-29］。BMSCs 的獲取主要有以下幾個步驟：（1）術前數(shù)天使用粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，GCSF）誘導骨髓干細胞，而后從脛骨或股骨中抽吸骨髓液，離心獲得細胞懸液。（2）在添加胎牛血清的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's modi fi ed Eagle's medium，DMEM）中混合培養(yǎng)3 h，隨后除去非貼壁細胞，更換新的培養(yǎng)基。（3）當原代BMSCs 達到90%匯合度時，用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化2 min，培養(yǎng)3周后獲得純化的紡錘形BMSCs［30-31］。獲得的BMSCs 可直接以細胞懸液的狀態(tài)注射進骨髓腔，或是將浸潤BMSCs的異體骨植入［25，32］。

3 BMSCs治療SONFH的研究現(xiàn)狀

近年來，有研究報告單純CD 與CD 聯(lián)合BMSCs 治療SONFH 的臨床結局無明顯差異，在SONFH 患者中植入BMSCs 的治療效果仍存在爭議［33-34］。Kang 等［25］采用配對設計的病例對照研究比較了100 例股骨頭壞死患者使用自體BMSCs 移植聯(lián)合髓芯減壓（50例）與單純髓芯減壓（50例）的療效，患者術后均進行1 年的隨訪，期間使用MRI 評價其分期，結果顯示，在股骨頭壞死早期進行自體BMSCs 移植并不能減緩其ARCO 分期的進展，這可能與SONFH 患者自體的BMSCs 成骨活性較低有關；若要提高BMSCs 治療SONFH 的效果，就需要保證BMSCs 在壞死區(qū)的存活和穩(wěn)定成骨分化。Zhang 等［35］使用成年新西蘭白兔建立SONFH 模型，從4~6周齡幼年新西蘭白兔股骨中分離BMSCs 傳代培養(yǎng)。在建模8周后，通過組織工程化骨移植術在股骨頭植入去抗原松質骨及BMSCs，對照組僅植入去抗原松質骨。術后12周發(fā)現(xiàn)2組股骨頭缺損修復效果無明顯差異。因此，單純BMSCs移植聯(lián)合CD技術治療SONFH的效果并無明顯優(yōu)勢。

因單純應用干細胞移植的治療效果不佳，許多學者嘗試在干細胞移植前對其進行修飾。Kong 等［19］將miR-137-3p沉默的BMSCs 移植至大鼠SONFH 模型中，發(fā)現(xiàn)其可以抑制SONFH 進展；此外，miR-137-3p 沉 默的BMSCs 通過增加SDF-1α的分泌，可增強SONFH 模型大鼠的血管形成和再生能力，而天然的BMSCs 并不具備這種能力。Yang 等［36］則用攜帶SDF-1α 的慢病毒質粒轉染BMSCs 以過表達SDF-1α，經過處理的BMSCs 的成骨能力顯著增強，后將其注射至SONFH 模型大鼠脛骨內，對照組注射未轉染慢病毒的BMSCs，3周后，micro-CT顯示治療組股骨頭壞死區(qū)面積明顯小于對照組。Zhang 等［37］在SONFH 大鼠飼料中添加氯化鋰（Wnt通路的天然激活劑），對照組喂食普通飼料，3周后氯化鋰組大鼠BMSCs的增殖和成骨能力均優(yōu)于對照組。以上研究表明，對BMSCs進行移植前修飾，可以提高BMSCs在股骨頭壞死區(qū)的存活率及其成骨能力，從而提升其對SONFH的療效。

4 小結與展望

基于BMSCs的多向分化潛能，研究者們創(chuàng)建了大量的動物模型進行實驗，并進行臨床應用。但諸多結果表明自體BMSCs移植治療SONFH效果并不顯著。通過移植前修飾可以增強BMSCs的增殖活性及成骨能力，從而在股骨頭壞死區(qū)發(fā)揮治療作用。但仍需對比研究不同的移植前修飾治療SONFH的效果及安全性，評估篩選出療效較優(yōu)的修飾靶點及劑量，以期能應用于SONFH的臨床治療。