拷貝數(shù)變異測(cè)序在稽留流產(chǎn)遺傳學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

覃穎，毛錦江，鐘文富

貴港市人民醫(yī)院產(chǎn)科1、檢驗(yàn)科2，廣西 貴港 537100

稽留流產(chǎn)(missed abortion，MA)是指胚胎或胎兒已死亡，滯留在宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出者[1-2]。8%～15%的孕婦在妊娠早期會(huì)發(fā)生自然流產(chǎn)，大多數(shù)發(fā)生在孕早期(7～11周)[3-4]，近幾年有增加趨勢(shì)。導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的原因眾多，隨著細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和對(duì)稽留流產(chǎn)遺傳原因的長(zhǎng)期研究，胎兒/胚胎染色體異常是稽留流產(chǎn)最常見(jiàn)的原因，約占75%，這種染色體異常是由于生殖細(xì)胞的遺傳物質(zhì)異常所致[3]。既往研究表明，育齡女性中有20%～30%的卵子和年輕健康男性中有6%～8%的精子存在染色體異常，通常是染色體數(shù)目異常[3]。拷貝數(shù)變異測(cè)序(CNV-seq)技術(shù)是采用一下代測(cè)序技術(shù)(NGS)檢測(cè)大于0.2 Mb DNA 序列的結(jié)構(gòu)變異，是一種從基因組的隨機(jī)片段拷貝中平行測(cè)序大量短DNA 鏈的技術(shù)。基于NGS 正迅速發(fā)展，CNV-seq作為一種低深度全基因組測(cè)序，在產(chǎn)前診斷、流產(chǎn)、先天性異常或神經(jīng)發(fā)育遲緩的患兒等臨床檢測(cè)染色體疾病中廣泛使用[2，4]。本研究利用CNV-seq 技術(shù)檢測(cè)對(duì)我院收治的稽留流產(chǎn)患者的絨毛/胎兒組織進(jìn)行遺傳學(xué)分析，以幫助確定病因，并提供遺傳咨詢，評(píng)估下一次妊娠的風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2021年12月在貴港市人民醫(yī)院產(chǎn)科就診的220例稽留流產(chǎn)患者的絨毛/胎兒組織，患者年齡17～46 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)臨床病史、實(shí)驗(yàn)室檢查和經(jīng)陰道超聲檢查診斷為稽留流產(chǎn)，所有稽留流產(chǎn)發(fā)生在胎齡6 至13 周之間，并接受流產(chǎn)物細(xì)胞遺傳學(xué)相關(guān)檢查的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕早期有不良接觸史和服藥史，生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常，糖尿病，精神病和免疫系統(tǒng)疾病的患者。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均于檢查前簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法 清宮手術(shù)或藥物流產(chǎn)終止妊娠排出的絨毛/胎兒組織，用0.9%氯化鈉溶液多次漂洗去除母體血液及污染物后挑取樣本，置于無(wú)菌容器中，4℃保存及運(yùn)輸，樣本送至深圳華大臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)。使用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物夠進(jìn)行單鏈分離和環(huán)化反應(yīng)，最終獲得帶有一個(gè)接頭的單鏈環(huán)狀DNA 文庫(kù)。采用PCR-free建庫(kù)方法建立單鏈環(huán)狀DNA文庫(kù)，利用華大自主測(cè)序平臺(tái)MGISEQ-2000 進(jìn)行測(cè)序，并利用測(cè)序儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件Zebracall 找到最終的CNV 結(jié)果。參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)、臨床基因組資源中心(ClinGen)等相關(guān)指南共識(shí)及數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CNV進(jìn)行解讀判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CNV-seq檢查結(jié)果 220例稽留流產(chǎn)患者進(jìn)行其絨毛/胎兒組織經(jīng)CNV-seq檢查，成功檢測(cè)215例，失敗5例，成功率為97.73%(215/220)。檢出異常染色體140例，占全部樣本的65.12%(140/215)，檢出正常染色體75例，占全部樣本的34.88%(75/215)。異常染色體中，數(shù)目異常型113 例(80.71%，113/140)，其中三體型82 例(58.57%，82/140)，最常見(jiàn)。16 號(hào)、22 號(hào)、15 號(hào)、21 號(hào)和14 號(hào)三體發(fā)生率最高，7例為兩條常染色體復(fù)合三體。三倍體18例(12.86%，18/140)，單體13例(9.29%，13/140)，主要見(jiàn)于X單體。嵌合體型13例(6.05%，13/215)；染色體節(jié)段缺失/重復(fù)14 例(6.51%，14/215)，見(jiàn)表1。

表1 流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常及類型(n=140)Table 1 Chromosome number abnormality and types of aborted embryos(n=140)

2.2 染色體嵌合體異常情況 本研究發(fā)現(xiàn)嵌合體13 例(6.05%)，其中，性染色體嵌合5例(包括X單體嵌合3 例)，常染色體三體嵌合8 例，分別為1 號(hào)和2 號(hào)和15 號(hào)復(fù)合三體嵌合1 例，21 單體嵌合1 例，2 號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、10號(hào)、15號(hào)、16號(hào)三體嵌合各1例。

2.3 染色體拷貝數(shù)變異情況 本研究發(fā)現(xiàn)染色體片段缺失/重復(fù)14 例(6.51%)，其中5 例染色體大片段缺失重復(fù)和2例為微缺失微重復(fù)綜合征為臨床致病性變異，1例良性變異，6例臨床意義不明確的變異，見(jiàn)表2。

表2 流產(chǎn)胚胎染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of chromosome copy number variation of aborted embryos

2.4 孕婦年齡與染色體的關(guān)系 本研究中，孕婦年齡＜35 歲者共153 例，染色體異常95 例，檢出率為62.09%；孕婦年齡≥35 歲者共62 例，染色異常體45 例，檢出率為72.58%，其中年齡≥35 歲組染色體異常的發(fā)生率更高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.137，P＞0.05)。

3 討論

3.1 流產(chǎn)與染色體數(shù)目異常的關(guān)系 近年來(lái)，稽留流產(chǎn)的發(fā)病率逐漸升高，病因復(fù)雜多樣，給孕產(chǎn)婦帶來(lái)嚴(yán)重的心理和社會(huì)負(fù)擔(dān)。研究表明胚胎或胎兒染色體異常是早期稽留流產(chǎn)最常見(jiàn)的原因，而染色體非整倍體改變是自然流產(chǎn)的重要原因[1，3]。本研究利用CNV-seq 對(duì)早期稽留流產(chǎn)患者的絨毛/胎兒組織進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)成功率為97.73%，檢出染色體異常為140 例，染色體異常率為65.28%，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[5]。染色體異常中以非整倍性為主，即染色體數(shù)目增加或減少，其中非整倍體113 例，占染色體異常的80.71%，除了1 號(hào)、3 號(hào)、5 號(hào)7 號(hào)和11 號(hào)染色體外，大多數(shù)染色體都存在非整倍體性，常染色體三體型占多數(shù)，占染色體異常的51.06%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果沒(méi)有區(qū)別，在大多數(shù)研究中，常染色體三體型發(fā)生率在33%～66%之間，但最常見(jiàn)的是50%左右[3]。本研究中16號(hào)、22號(hào)、15號(hào)、21號(hào)、14號(hào)染色體三體占比例最高，這5 條染色體三體占所有三體型的67%，都是比較小的染色體，容易發(fā)生非整倍體異常，大多數(shù)在早期妊娠中流產(chǎn)，活產(chǎn)兒中21 三體最常見(jiàn)，而大的常染色體1 至6 號(hào)染色體中的非整倍體是最不常見(jiàn)的。單體型13 例，主要為45,X，性染色體X 單體在流產(chǎn)兒和活產(chǎn)兒中都可見(jiàn)到，但性染色體三體在流產(chǎn)兒中不常見(jiàn)[1]。兩條常染色體復(fù)合三體7 例，分別為9 號(hào)和16 號(hào)、7 號(hào)和15號(hào)、2 號(hào)和14 號(hào)、15 號(hào)和21 號(hào)、16 號(hào)和21號(hào)、14號(hào)和17號(hào)染色體復(fù)合三體各1例。本研究結(jié)果表明孕早期胚胎染色體異常是導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的主要原因之一，染色體非整倍體是早期流產(chǎn)最常見(jiàn)的染色體異常。

3.2 稽留流產(chǎn)與染色體嵌合體的相關(guān)性 本次研究檢測(cè)出嵌合體13 例，占染色體異常的9.29%，其中3例為X單體嵌合，性染色體嵌合2 例，常染色體三體嵌合8例。嵌合體是指含同時(shí)存在兩種或兩種以上核型的細(xì)胞系的個(gè)體。其發(fā)生機(jī)制主要是早期胚胎發(fā)育過(guò)程中有絲分裂和減數(shù)分裂錯(cuò)誤，導(dǎo)致個(gè)體同時(shí)存在兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞系[6-7]。1%～2%的胎盤(pán)組織(絨毛)可發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)嵌合體。多數(shù)妊娠胎盤(pán)組織(絨毛)與胎兒的核型一致，但當(dāng)存在限制性胎盤(pán)嵌合體(CPM)時(shí)，胎盤(pán)組織(絨毛)中可能存在幾種不同比例的細(xì)胞系核型，多為染色體非整倍體，而胎兒核型無(wú)異常[3]。本研究中，研究的主要組織是絨毛膜的細(xì)胞滋養(yǎng)層，可能涉及或沒(méi)有涉及胚外中胚層，很難評(píng)估嵌合體涉及胚胎外組織所占比例，以及是否與正常或異常的胎兒核型或母體細(xì)胞污染有關(guān)[3]。有研究認(rèn)為，大多數(shù)胎盤(pán)嵌合體胎兒可以妊娠至足月，沒(méi)有合并畸形或異常，但有些會(huì)導(dǎo)致宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)、早產(chǎn)、胎盤(pán)功能不全和流產(chǎn)。在健康人的各種組織(包括大腦、血液和皮膚)中，嵌合體的發(fā)病率很高，染色體嵌合體可能與包括精神疾病、自身免疫性疾病和先天性畸形等多種疾病有關(guān)[8]。

3.3 稽留流產(chǎn)與染色體CNV的相關(guān)性 研究表明，有些致病性的CNV與發(fā)育遲緩、智力障礙、特殊面容、多發(fā)畸形、癲癇等相關(guān)，有些含有重要基因片段的CNV缺失和重復(fù)可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形或死亡，但與稽留流產(chǎn)是否相關(guān)還需更多的研究來(lái)驗(yàn)證[9-10]。本研究中檢出有臨床意義染色體CNV 8 例(檢出率為3.72%)，其中有5 例為大片段缺失和(或)重復(fù)，涉及大量的功能基因，為致病性變異，另外有2例分別為16號(hào)微缺失綜合征和19 號(hào)微缺失綜合征，缺失長(zhǎng)度均在5 Mb 以下，1 例14 號(hào)長(zhǎng)臂微重復(fù)為良性變異，這些微小變異常規(guī)G 顯帶染色體核型分析不能檢測(cè)出的染色體異常。由此可見(jiàn)，對(duì)絨毛/胎兒組織進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析可提高染色體異常檢出率，能夠發(fā)現(xiàn)更多罕見(jiàn)的微缺失微重復(fù)綜合征，為遺傳咨詢提供依據(jù)，指導(dǎo)再次妊娠。本研究檢出臨床意義不明確CNV 的病例6例，檢出率為2.79%，這類病例CNV的結(jié)果解讀與遺傳咨詢，需通過(guò)夫婦雙方進(jìn)行同種類型CNV-seq 檢測(cè)以驗(yàn)證變異來(lái)源。若CNV是遺傳性的，則臨床指導(dǎo)意義較小，若為新發(fā)的變異，則臨床指導(dǎo)意義較大，但仍需要考慮不完全外顯和臨床表型差異的影響[11]。

3.4 染色體異常與患者年齡的相關(guān)性 研究表明，胚胎染色體發(fā)生非整倍性改變隨著年齡的增長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，在28～29歲時(shí)染色體非整倍性發(fā)病率最低，為25%，35歲后急劇上升，在45歲時(shí)達(dá)到90%的峰值[2，7]。從機(jī)制上講，隨著年齡的增加，卵細(xì)胞質(zhì)量下降，卵細(xì)胞在有絲分裂和減數(shù)分裂過(guò)程中延滯，導(dǎo)致染色體的異常。本研究結(jié)果顯示年齡≥35 歲組的染色體異常率高于年齡＜35 歲組，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是本研究樣本量較少，未來(lái)需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)。

3.5 CNV-seq 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及臨床意義 常規(guī)G顯帶染色體核型分析是檢測(cè)染色體非整倍性和不平衡易位的金標(biāo)準(zhǔn)，但總體檢測(cè)失敗率為20%，當(dāng)出現(xiàn)母體細(xì)胞污染時(shí)會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。常規(guī)G 顯帶染色體核型分析僅能檢測(cè)＞5 Mb 的染色體節(jié)段改變，且存在分辨率低、成本較低、細(xì)胞培養(yǎng)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。熒光原位雜交(FISH)、多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)和定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(QF-PCR)等技術(shù)克服了傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)的一些缺點(diǎn)，但因其分辨率不高，未能對(duì)全基因組覆蓋而在臨床中受到限制[2-3]。隨著下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)的發(fā)展，CNV-seq 是一種高通量基因測(cè)序技術(shù)，具有周期短、分辨率高、通量高、成本低、只需要少量DNA、高診斷性能等特點(diǎn)。臨床上特別是在僅有少量組織時(shí)，CNV-seq 可能是不夠用于成功的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行遺傳學(xué)核型分析；或細(xì)胞培養(yǎng)失敗時(shí)，CNV-seq 是核型分析的可行替代或補(bǔ)充方法，用于準(zhǔn)確識(shí)別與流產(chǎn)相關(guān)的已知染色體原因，適用于研究流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因，具有相對(duì)較高的基因組分辨率和精確定量拷貝數(shù)的能力，可提高胚胎染色體異常的診斷率[2]。

綜上，染色體數(shù)目異常是導(dǎo)致早期流產(chǎn)最常見(jiàn)的染色體異常。應(yīng)用CNV-seq對(duì)流產(chǎn)物進(jìn)行染色體檢測(cè)為早期流產(chǎn)的遺傳學(xué)檢測(cè)提供更多的遺傳信息，為稽留流產(chǎn)的病因和遺傳咨詢提供依據(jù)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)再次妊娠具有很好的指導(dǎo)意義。