植物雌激素調控牙髓干細胞成骨分化的研究進展

劉夢達 綜述 馮紅超，閆明 審校

1.遵義醫科大學口腔醫學院，貴州 遵義 563000；2.貴陽市口腔醫院，貴州 貴陽 550002；3.遵義醫科大學，貴州 遵義 563000

外傷、腫瘤、炎癥及先天性疾病是導致口腔頜面部骨缺損的主要原因，對患者的身心健康都可造成嚴重影響，而傳統的骨移植修復技術存在二次創傷、術后感染、愈合延遲和免疫排斥反應等問題，難以完全恢復患者缺損部位的結構和功能。隨著再生醫學研究不斷發展，現可通過組織工程手段修復頜骨缺損，并恢復頜面部結構和功能[1]，牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)可分化為成骨細胞、神經樣細胞、軟骨細胞、成血管內皮細胞等，具有取材方便、創傷小、來源廣泛、免疫原性較低、可長期凍存等優點[2]，成為骨組織工程的重要種子細胞。植物雌激素是一類可發揮雌激素樣作用的天然化合物，可通過多種途徑上調成骨細胞活性，研究發現多種植物雌激素對DPSCs有促增殖與成骨分化的作用，本文就目前植物雌激素調控DPSCs成骨分化的研究進展綜述如下：

1 DPSCs

DPSCs表現出與骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)相似的特征，包括克隆形成和自我更新能力[3]，具有較好的增殖潛力，又能多系分化，產生不同的細胞譜系，具有成骨、軟骨、成脂、神經和肌肉生成的潛能，以及很高的礦化潛力[4]。DPSCs具有取材方便、創傷小等優點，它們的冷凍保存能力是另一個主要優勢，使它們能夠更方便地獲取[5]，非常適合作為種子細胞應用于組織工程。

2 植物雌激素

一系列科學研究表明，雌激素通過調節多種信號分子或與其他信號通路相互作用來調節骨代謝。植物雌激素是一類從植物、水果和蔬菜中提取，結構和生物活性均類似于雌激素的非甾體類化合物，主要有三類：異黃酮類、木脂素類和香豆素類，具有弱雌激素活性，與雌激素的作用相似，可與細胞上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)結合，發揮激動劑、拮抗劑作用[6]。植物雌激素可與破骨細胞的雌激素受體結合，抑制破骨細胞的活性；當與成骨細胞的雌激素受體結合時,可誘導細胞釋放成骨相關因子，增強成骨細胞的活性，促進骨質生長，加速骨形成[7]，廣泛應用于絕經后婦女骨質疏松的雌激素替代療法(ERT)，優勢在于治療和預防絕經后女性骨質流失的同時，避免發生ERT的并發癥[8]。

2.1 鷹嘴豆芽素A(biochanin A，BCA) BCA 主要來源于大豆類植物鷹嘴豆的胚芽，屬于一種異黃酮類化合物，是紅車軸草的主要效力來源，具有保護神經、抗炎、抗感染、抗癌、抗氧化、保肝以及類雌激素等多種藥理作用[9]，研究證明BMSCs經BCA處理可增強礦化活性，刺激成骨標記基因堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(osteocalcin，OCN)的表達，誘導Runt 相關轉錄因子2 (Runx2)、護骨素(OPG)和Ras 同源基因家族成員A(RhoA)蛋白的表達，增強間充質干細胞成骨分化能力，調節骨形成[10]。同時BAC 治療可抑制炎癥反應，調節不平衡的氧化應激反應，改善牙槽骨丟失[11]；Liao等[12]研究發現，BCA 通過下調破骨細胞相關基因TNF-α(腫瘤壞死因子-α)、IL-1α(白介素1-α)和IL-1β(白介素1β)的分泌水平，有效地抑制破骨細胞的形成，降低羥基磷灰石的吸收，進一步的機制分析表明，這期間BCA 抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路，包括MAPKs通路中的主要3 條通路：p38 通路、細胞外信號調節激酶(ERK)通路以及c-Jun氨基末端激酶通路(JNK)，同時BCA還抑制了核因子-κB(NF-κB)信號通路，從而下調破骨細胞基因表達。在去卵巢(OVX)大鼠模型中，BCA在體外誘導前成骨細胞分化為成骨細胞，并增加成骨細胞礦化，同時抑制破骨細胞的增殖，Su 等[13]進一步研究發現，BCA 或17β-雌二醇(E2)治療均可抑制去卵巢大鼠尿脫氧吡啶酚、血清TNF-α和IL-1α的升高，提示BCA抑制破骨細胞活性的作用可能與雌激素信號通路有關。謝昕儒等[14]最新研究中，蛋白免疫印跡實驗顯示，10 μmol/L BCA通過激活P38/MAPK 信號通路，顯著提升p38 的磷酸化水平，提高成骨標志基因ALP、Ⅰ型膠原(type I Collagen，COL-1)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、OCN的表達水平，從而促進人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)成骨向分化。

2.2 大豆苷元(daidzein，DD) 大豆苷元(DD)又稱黃豆苷元，是一種天然的異黃酮類物質，廣泛存在于豆科類植物，尤其在大豆中含量較高，是大豆異黃酮的主要效力成分。作為一種植物雌激素，DD 具有類似雌二醇的結構，對骨質疏松癥具有保骨作用。王川等[15]最新研究發現，DD 促進人成骨樣MG-63 細胞OPG的mRNA和蛋白表達的同時，還抑制了核因子ⅠκB 受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factorⅠκB ligand，RANKL)的mRNA 和蛋白的表達，改善骨吸收癥狀，雌激素受體(ER)阻斷劑ICI 182780可拮抗該作用，提示DD可能通過與ER結合來促進OPG以及抑制RANKL的表達，進一步研究發現DD促進細胞成骨的作用是由ERα和ERβ共同介導的；王志平等[16]研究發現DD 不僅刺激MG-63 細胞增殖，還通過增強MG-63 細胞經典的雌激素反應元件(estrogen response element，ERE)的基因轉錄活性，發揮促進細胞成骨的作用，其機制可能與升高ERα、ERβ及其相關的類固醇受體共激活因子(steroid receptor coactivator，SRC-1)的表達水平有關。Jin 等[17]研究顯示DD 通過增加ALP 活性和膠原蛋白含量來促進人成骨細胞樣MG-63 細胞分化，與ER 拮抗劑ICI 182780 共同處理可防止此作用，驗證了DD通過ER依賴的信號通路刺激成骨這一假設，其機制還可能與絲裂原激活的蛋白激酶/細胞外調節激酶(MEK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路的激活有關。武斌等[18]的研究初步證實一定濃度(0.1 μmol/L)的DD可促進人乳牙牙髓干細胞(SHEDs)的增殖，同時DD呈劑量依賴性地調高ALP 和OCN 的基因和蛋白表達，進一步檢測發現其促進SHEDs 成骨的機制還可能與提高轉化生長因子-β(TGFⅠβ)的表達有關。

2.3 槲皮素(quercetin) 槲皮素屬于黃酮類化合物，主要來源于蜂膠，具有多種臨床功效，能發揮較強的抗炎、抗感染、抗氧化、抗病毒以及免疫調節的作用，對骨代謝也具有積極的藥理作用。Pang 等[19]研究結果顯示，槲皮素能顯著促進小鼠BMSCs 的增殖、ALP 活性和細胞外基質的生成及礦化，qPCR 及Western blotting 結果表明，槲皮素促進骨形態發生蛋白2(BMP2)、Smad1、Smad4、RUNX2、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix，OSX)的表達和Smad1的磷酸化，用ER抑制劑ICI182780 處理可阻斷槲皮素的這些作用，提示槲皮素通過與ER相互作用刺激BMP 信號轉導，導致下游轉錄因子RUNX2 和OSX 的表達增加，最終刺激BMSCs 分化和礦化。Li 等[20]在研究槲皮素對大鼠BMSCs成骨分化中MAPK信號通路的影響實驗中發現，10 μmol/L 槲皮素處理組p38MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平和ALP、COL-I、骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BGP)的蛋白表達水平以及TGF-β1、BMP-2 和核心結合因子α1(CBF-α1)的mNRA 表達水平升高最明顯，而SP600125 (JNK 抑制劑)和PD98059 (ERK1/2 抑制劑)的加入可以顯著拮抗這些成骨作用，證明槲皮素通過激活MAPK信號通路促進BMSCs的成骨分化，其中ERK1/2 和JNK 信號通路是其中主要途徑。Wei 等[21]在骨內植入物骨整合研究中發現，槲皮素對促進大鼠BMSCs 成骨分化、抵抗多種病原體和降低炎癥活性具有顯著的增強作用，較強的抗炎、抗菌能力讓其可作為藥物輸送系統促進炎癥植入部位骨整合的關鍵藥物，抵抗多種病原體，減少炎癥活動。Zhang 等[22]研究發現，槲皮素獨特的抗炎作用還體現在通過抑制NF-κB/NLRP3 通路，顯著減弱了TNF-α誘導的炎性hPDLSC 中成骨相關基因和蛋白質表達、堿性磷酸酶(ALP)活性和礦化基質的抑制情況，增強炎性狀態下人牙周膜干細胞(hPDLSCs)的成骨分化能力，證明槲皮素或許是治療牙周炎骨缺損的潛在治療方法。在組織工程應用方面，Song 等[23]將種植了rBMSCs 的槲皮素/絲素蛋白/羥基磷灰石(Qtn/SF/HAp)支架植入骨缺損部位，結果顯示支架與周圍組織結合良好，具有良好的細胞相容性，槲皮素在植入過程中有效地促進了rBMSCs 向成骨細胞分化，從而為高性能骨組織再生提供潛在的替代移植物。胡韶光等[24]研究發現，加入槲皮素的人牙髓干細胞(hDPSCs)支架復合體能夠起到促進修復兔顱骨缺損作用，提高ALP 的活性水平，增強礦化結節形成，增加BMP2、Runx2、OPN 和OCN等促進成骨基因的表達量，證明槲皮素在人牙髓干細胞的增殖和成骨分化中起重要作用。

2.4 淫羊藿苷(icariin，ICA) 短淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)是一種用于減輕炎癥和恢復成骨的中藥[25]。ICA是從短尾淫羊藿中提取得到的類黃酮化合物，是其主要有效活性成分，是一種骨代謝相關疾病中的常用藥物，臨床應用于預防絕經后婦女骨質流失治療。轉錄調控因子在終末成骨分化過程中激活Runx2 基因，在BMSCs 成骨分化中起重要作用，Wei 等[26]的研究結果表明ICA(0.1 μmol/L)通過增加TAZ 表達促進rBMSCs 的成骨分化，但ICA 的這些作用可被雌激素受體α抑制劑ICI 182780 或Wnt/β-連環蛋白通路(β-catenin)抑制劑DKK1阻斷，提示ICA促進rBMSCs成骨主要是通過ERα和Wnt/β-catenin途徑來實現的。而Ho等[27]發現ICA作為一種植物雌激素，在成骨細胞中介導雌激素作用的機制較為獨特，可選擇性激活非基因組雌激素信號，特別是Akt 磷酸化，從而發揮優越的成骨和抗凋亡作用。Xu 等[28]研究表明，ICA通過抑制Notch信號通路，緩解去卵巢(OVX)小鼠體內骨質疏松，促進成骨分化。這可能與ICA增加小鼠BMSCs的自噬活性來增強細胞成骨分化能力有關[29]。miR-23a-3p是股骨頭壞死(ONFH)患者中最顯著上調的一類miRNA，而在細胞成骨向分化過程中顯著下調，Zhang等[30]研究表明，ICA通過降低miR-23a-3p水平，調節BMP-2/Smad5/Runx2 和Wnt/β-catenin 通路，促進BMSCs 增殖和成骨分化活性并改善ONFH。此外，ICA 還被報道可以顯著促進人羊膜間充質干細胞(hAMSCs)和人牙髓干細胞(hDPSCs)的增殖和成骨分化，上調OCN、Runx2 和BMP2 的基因和蛋白表達，促進干細胞的成骨功能活性[31-32]，提示采用ICA 代替常規生長因子應用于骨組織工程具有一定可行性。

2.5 骨碎補總黃酮(total flavonoids of rhizoma drynariae，TFRD) TFDR 是補腎中藥骨碎補(rhizoma drynariae)中的主要成分之一，具有抗骨質疏松、骨折和炎癥的藥理活性，已被證明對骨骼系統具有多方面的藥理作用。宋雙紅[33]將大鼠去卵巢(OVX)構建絕經后骨質疏松模型，實驗中TFRD 表現出較強的類雌激素效應，能有效阻止OVX大鼠因雌激素分泌減少引起的骨質疏松和骨質流失，增加OVX 大鼠骨量，并且未刺激大鼠子宮；進一步在細胞和分子水平研究發現，TFRD 可以促進MC3T3-E1 前成骨細胞增殖、成骨分化，形成大量礦化結節，期間明顯上調ERα和ERβ蛋白的表達，對OPG 和RANKL 分別表現出促進和抑制作用，提示TFRD可能不僅通過ER信號通路表現出較強的雌激素效應，防止OVX大鼠雌激素缺乏引起的骨量減少，還可以協同OPG/RANKL 信號通路發揮作用，促進成骨細胞活性。Shen等[34]研究發現TFRD可顯著提高應激條件下內皮祖細胞(EPC)的血管生成能力和BMSCs的成骨能力，設計阻斷PDGF-BB(血小板衍生生長因子-BB)來抑制BMSCs 的成骨分化，而過程中TFRD既改善了BMSCs的成骨抑制作用，又增強其成骨活性，表現為鈣結節增多，ALP活性升高，RUNX2和OSX的mRNA和蛋白表達水平升高[35]。黃曉菲等[36]研究發現，通過介導PI3K/Akt信號通路，TFRD還可促進大鼠DPSCs增殖及成骨分化，且表現出濃度和時間依賴性促進成骨效能。Li等[20]研究TFRD在誘導膜技術中對大鼠骨移植物礦化和成骨細胞分化的影響，體內實驗表明，TFRD組骨移植物的生長和礦化較好，骨組織中β-catenin、COL1(Ⅰ型膠原)、BMP-2和OPN成骨相關蛋白的表達高于對照組；體外實驗表明，TFRD組成骨細胞增殖較快，ALP 活性較高，礦化結節數量較多，但阻斷Wnt/β-catenin信號通路會限制這些影響，提示TFRD 能夠促進骨移植物的礦化和成骨細胞的分化，這可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關。

2.6 柚皮苷(Naringin) 柚皮苷是從柑橘類水果中提取的主要黃酮類化合物，是中藥骨碎補的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗潰瘍、抗骨質疏松和抗癌特性[37]，有顯著的類雌激素作用，具有促進骨形成的作用。Pang 等[38]發現柚皮苷可防止小鼠卵巢切除術引起的骨質流失，顯著誘導ERα的磷酸化，對小鼠成骨細胞功能的刺激作用可通過與雌激素受體拮抗劑ICI182780 共同孵育而被抑制，這提示柚皮苷可能是通過激活非配體依賴的成骨細胞內雌激素受體(ER)來實現促進成骨作用的。Wang等[39]則采用雙抗體夾心法測定骨代謝指標，發現柚皮苷通過靶向抑制JAK2/STAT3 信號通路促進BMSCs 的成骨分化，從而改善去卵巢(OVX)誘導的大鼠絕經后骨質疏松癥(PMOP)發展。Liu 等[40]發現柚皮苷在1～100 μg/mL 范圍內以劑量依賴性方式增強人羊水干細胞(hAFSCs)的增殖和ALP 活性及鈣化含量，OPG、OPN、COL-I、BMP-4、RUNX2、β-catenin和細胞周期蛋白D1的基因表達也顯著增加，同時下調RANKL的表達，提示柚皮苷不僅促進成骨細胞分化，也能抑制破骨細胞的形成，通過BMP和Wnt-β-catenin信號通路促進hAFSCs成骨。Guo等[41]使用柚皮苷處理hDPSCs，增強ALP活性和礦化水平，并提高Runx2、OPN、DSPP(牙本質涎磷蛋白)和DMP1(牙本質基質蛋白1)的基因表達，從而促進hDPSCs 的增殖、遷移和成骨，Western 印跡結果顯示柚皮苷顯著激活hDPSCs的Wnt/β-catenin信號轉導通路；Zheng 等[42]進一步研究發現柚皮苷顆粒對hDPSCs 的甘油磷脂代謝途徑有很大的影響，通過上調磷脂酶A2的兩種同工酶PLA2G3和PLA2G1B的表達，促進溶血磷脂酸(LPA)的生物合成，從而促進hDPSCs成骨分化。Wang等[43]研究表明柚皮苷明顯促進hBMSCs 的增殖，還以劑量依賴性方式增強hBMSCs 的成骨分化并上調成骨標志物RUNX-2、OXS、OCN 和COL1 的蛋白和mRNA 表達水平，加入ERK抑制劑U0126后，柚皮苷對細胞成骨分化的促進作用和對ERK信號通路的激活均被逆轉，提示柚皮苷通過激活ERK信號通路促進hBMSCs的增殖和成骨。

2.7 芹菜素(apigenin) 芹菜素是一種黃酮類化合物，在天然植物中含量豐富，主要存在于芳香植物(如洋甘菊、薄荷、歐芹)、蜂蜜和小麥中。越來越多的證據表明，芹菜素具有抗炎、抗氧化和抗癌活性，以及明顯的雌激素樣作用[44]，據報道可預防去卵巢小鼠的骨質流失。Pan等[45]研究發現芹菜素在體外可增強關鍵轉錄因子β-catenin 及其下游幾個Wnt 信號的靶基因的表達，從而激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進人間充質干細胞(hMSCs)的成骨分化，使用大鼠股骨骨折模型，發現芹菜素在體內表現出促進新骨形成和加速骨折愈合的作用。Zhang 等[46]則提出，芹菜素可顯著提高hMSCs 中p-JNK、p-p38 的表達水平，加入JNK抑制劑(SP600125)或p38MAPK 抑制劑(SB203580)可阻斷芹菜素誘導的ALP 活性、OPN、Runx2 和OSX 的表達，提示芹菜素或許是通過激活JNK 和p38MAPK信號通路，促進hMSCs 的成骨，誘導骨結節的形成。汪芹芹等[47]證明一定濃度(5 μmol/L)下的芹菜素可以刺激hDPSCs增殖，誘導其成骨向分化，提高成骨標志基因OCN 與RUNX2 的表達，且在hDPSCs 聯合植骨材料修復兔顱骨缺損中，芹菜素有明顯的促進成骨作用，或許將來可以為臨床骨缺損提供新的修復方案。

2.8 黃芩苷(Baicalin) 黃芩苷是中藥黃芩中的主要有效成分，是一種天然生物活性黃酮類化合物，具有很強的抗炎、抗氧化等多種生物活性。作為一種植物雌激素，黃芩苷可以模擬雌激素作用，抑制人乳腺癌雌激素受體陰性細胞株MDA-MB-231細胞的增殖，誘導細胞凋亡[48]。Kimura等[49]發現用黃芩苷處理人成牙骨質細胞(HCEM)，上調ALP 和Runx2 的mRNA表達，促進ALP和Runx2的蛋白水平、ALP活性和鈣沉積，加入Wnt 信號通路阻斷劑DKK-1 可抑制這些成骨刺激作用，提示黃芩苷可通過Wnt/β-catenin信號通路促進HCEM 向成骨細胞分化，可能有助于牙周組織再生工程。馬永剛等[50]研究發現，高濃度黃芩苷對人根尖乳頭干細胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)的成骨分化表現出明顯抑制作用，而低濃度黃芩苷對SCAPs成骨分化及細胞生長有促進作用，20 μmol/L黃芩苷可顯著增強DPSCs 的RUNX2、DSP、OSX、OPN、OCN等成骨標志基因的mRNA和蛋白表達，甚至能緩解或糾正由炎癥引起的DPSCs分化能力下降問題。

3 展望

頜面部骨缺損是臨床常見疾病，為了恢復患者缺損部位的結構和功能，使用骨組織工程手段修復頜骨缺損或許是更好的選擇。骨組織工程除了構建支架外，還需要尋找合適的種子細胞和成骨誘導因子，DPSCs在骨再生方面具有許多優勢，包括較高的增殖率、良好的成骨分化潛能以及較低的免疫原性等，此外還具有來源豐富、取材方便、可長久冷凍保存等優點。植物雌激素能作為一種有效的誘導劑應用于DPSCs的培養及誘導成骨，有些植物雌激素直接作用于DPSCs 上的雌激素受體發揮作用，或是通過各種信號通路如ER、MAPKs、Wnt/β-catenin、NF-κB 信號通路和BMP-2 途徑等，調節靶基因的表達，誘導產生各種細胞因子間接影響DPSCs增殖與成骨分化，或許可以為骨組織工程修復頜骨缺損提供新的思路。

然而就目前的研究狀況而言，植物雌激素在調控DPSCs成骨分化方面還存在一定的局限，除了淫羊藿苷、柚皮苷、大豆苷元等幾種知名類雌激素研究得較為深入外，其他植物雌激素的研究內容相對不足，植物雌激素的濃度等級、DPSCs上雌激素受體基因的編碼轉錄與表達調控、如何構建細胞支架等尚存在一定的爭議，需進一步研究。