血清外泌體miR-96表達與老年糖尿病患者骨質疏松的相關性

吳麗明，宋成福，金鹿，楊紫姣

楊浦區中心醫院老年科，上海 200090

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，也是糖尿病患者常見并發癥之一[1]。研究顯示，與正常人群相比，1/2～2/3的糖尿病患者存在骨強度下降現象，同時糖尿病患者發生OP的比率高達50%[2]。糖尿病和骨質疏松是老年人的常發病，隨著年齡增長，骨質疏松及跌倒風險增加并導致骨折發生率，不僅影響老年人生活質量，還會增加住院及死亡風險[3]。目前，臨床尚缺乏有效的OP治療方案，且現有治療方案副作用突出，難以改變病理進程及成骨細胞增殖分化[4]。因此，探究老年糖尿病患者發生骨質疏松的影響因素以及病情進展相關分子機制，對該病早期診斷、臨床治療有重要意義。外泌體(exosomes，EXOs)為直徑30～100 nm 的盤狀囊泡，內部包裹了miRNA、蛋白等物質，是生物分子在骨重建微環境中發送細胞間信息的載體[5]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類單鏈非編碼RNA，在轉錄后參與細胞增殖、分化等過程，并且在生物信號調控網絡中扮演重要角色[6]。研究顯示，外泌體miRNA參與骨微環境中的骨吸收與骨生成，miRNA異常表達可導致骨質疏松等一系列骨代謝相關疾病[7]。近期有研究發現，miR-96 在老年骨質疏松患者血清、骨髓基質細胞中上調表達，并參與調節骨代謝[8]。此外，研究外泌體中異常表達的miRNA在骨重建中的作用，對理解骨質疏松病理機制及骨質疏松的診斷具有一定臨床應用價值。但miR-96 與老年糖尿病合并骨質疏松的關系尚未明確。基于此，本研究通過檢測老年糖尿病患者血清外泌體中miR-96 表達，分析其與骨質疏松的相關性，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年1 月至2021年5 月楊浦區中心醫院老年科收治的年齡≥60 歲的171例2型糖尿病患者的臨床資料，其中男性86例，女性85 例，平均年齡(68.87±6.80)歲。納入標準：(1)年齡≥60 歲；(2)所有2型糖尿病患者經臨床檢查均符合《中國2 型糖尿病防治指南(2017 年版)》[9]中相關診斷標準；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)有服用鈣劑、皮質類固醇激素、維生素D等影響骨代謝的藥物使用史(3個月內)；(2)合并有嗜鉻細胞瘤、胸腺瘤等疾病；(3)合并有糖尿病高滲狀態；(4)肝、肺、腎、腦、心等器官損害者；(5)合并有骨髓增生異常綜合征等繼發性骨代謝異常疾病；(6)合并酮癥酸中毒；(7)合并甲狀旁腺疾病、甲狀腺疾病。基于雙能X線法測定骨密度(bone mineral density，BMD)分類標準[10]：T 值=(骨密度測定值-同性別同種族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度標準差進行分組，T 值≤-2.5 為骨質疏松(OP 組，82 例)，T 值≥-1.0 或-2.5＜T 值＜-1.0 為正常或低骨量(非OP 組，89 例)。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均為自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標與方法

1.2.1 一般資料收集及骨代謝檢測 收集入組者的年齡、性別、病程、體質指數(BMI，kg/m2)、超敏-C反應蛋白(hs-CRP)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、糖化血紅蛋白(HbAlc)、總膽固醇(CHOL)、空腹C 肽、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)等指標。所有受試者均于早上空腹抽取肘靜脈血，并在離心機上以3 000 r/min轉速離心5 min，隨后分離血清，-80℃冷凍箱貯存備用。采用酶聯免疫法檢測血清25-羥維生素D3[25(OH)D3]、I 型膠原羧基端肽交聯(β-CTX)、甲狀旁腺激素(PTH)、骨鈣素(BGP)、I型前膠原氨基末端前肽(PINP)水平。25(OH)D3(批號：H995860)、β-CTX(批號：E-EL-H0835)檢測試劑盒由上海玉博生物科技有限公司提供，PTH(批號：H207)、PINP(批號：H285)、BGP(批號：H152)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，檢測儀器為全自動生化分析儀(型號：BS-800，邁瑞醫療)，嚴格按照說明書操作。

1.2.2 骨密度檢測 雙能X 線骨密度檢測儀(型號：Dexa Pro-l，徐州品源醫療科技有限公司)測定患者的雙側髖部(粗隆間、大轉子、股骨頸)骨密度及正位腰椎(L1～4)骨密度。

1.2.3 提取血清外泌體 所有受試者均于早上空腹抽取肘靜脈血，離心后收集上層血清，使用外泌體提取試劑盒(批號：BB-39022，貝博生物)提取血清外泌體，提取后用于下一步的RNA提取及酶聯免疫吸附試驗。

1.2.4 外泌體中miR-96 表達水平檢測 使用Trizol 法(批號：15596-026，Life Technologies，美國)裂解血清外泌體，硅膠膜吸附柱過濾純化，超微量核酸蛋白分析儀(型號：MD2000D，Biofuture，英國)檢測RNA 質量與濃度，然后取1μg RNA 按照反轉錄試劑盒(批號：MR101-01，Vazyme，中國)步驟進行反轉錄，使用SYBR Green 染料(批號：MQ101-01，Vazyme，中國)在LightCycler 480 儀器定量儀(Roche Diagnostics，瑞士)上進行PCR 反應，反應程序為：95℃5 min；95℃10 s、60℃30 s，重復2、3 步驟40個循環。引物序列如下：miR-96 (F：CAUCUGAAUAGACGATTAG-3'，R：GAUAGCACUAGCCGC)，U6 (F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R：5'-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3')，由上海生工生物公司合成。以U6 為內參，利用2-△△Ct法計算血清外泌體中miR-96相對表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS21.0 軟件進行數據統計學分析。計數資料以例(%)比較，采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以均值±標準差(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson 相關分析法分析miR-96與BMI、BGP、25(OH)D3、β-CTX、PTH、HbA1c、PINP 的相關性。多因素Logistic 回歸分析影響老年糖尿病患者發生骨質疏松的相關因素。受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristics，ROC)分析血清外泌體miR-96對老年糖尿病患者并發骨質疏松的診斷價值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的臨床資料比較 非OP 組與OP組的BMI、β-CTX、25(OH)D3、HbAlc、PTH、BGP、PINP比較差異均有統計學意義(P＜0.05)；非OP 組與OP 組的性別比例、病程、年齡、Hs-CRP、TG、HDL-C、CHOL、LDL-C及空腹C肽比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩組患者的臨床資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of clinical data of two groups of patients [±s，n(%)]

表1 兩組患者的臨床資料比較[±s，例(%)]Table 1 Comparison of clinical data of two groups of patients [±s，n(%)]

項目男/女年齡(歲)BMI(kg/m2)病程(年)Hs-CRP(mg/L)HbAlc(%)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)CHOL(mmol/L)空腹C肽(ng/mL)β-CTX(ng/L)BGP(ng/mL)PINP(ng/L)PTH(pg/mL)25(OH)D3 (ng/mL)非OP組(n=89)47(52.81)/42(47.19)68.30±4.52 24.53±3.94 9.47±7.06 3.79±1.02 7.96±1.13 1.49±0.32 1.27±0.26 2.96±0.45 4.83±1.04 1.24±0.25 9.25±2.31 15.91±2.87 42.39±5.26 41.58±6.94 17.62±3.43 OP組(n=82)39(47.56)/43(52.44)69.48±5.10 23.17±3.68 9.84±6.78 4.05±1.17 8.32±1.04 1.56±0.37 1.19±0.31 3.04±0.41 4.91±1.09 1.30±0.27 14.68±3.06 8.60±2.04 47.12±6.19 48.74±7.60 12.45±1.82 χ2/t值0.470 1.604 2.327 0.349 1.552 2.162 1.326 1.833 1.212 0.491 1.509 13.160 19.051 5.398 6.439 12.161 P值0.493 0.111 0.021 0.728 0.123 0.032 0.187 0.069 0.227 0.624 0.133 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組患者的血清外泌體miR-96表達水平比較 OP 組患者血清外泌體miR-96 表達水平為1.42±0.31)，明顯高于非OP組的1.01±0.25，差異有統計學意義(t=9.554，P＜0.05)。

2.3 血清外泌體miR-96與各變量的相關性 經Pearson 相關分析結果顯示，血清外泌體miR-96 與BMI、BGP、25(OH)D3呈 負 相 關，與β-CTX、PTH、HbA1c、PINP呈正相關(P＜0.05)，見表2。

表2 血清外泌體miR-96與各變量的相關性Table 2 Correlation between serum exosome miR-96 and various variables

2.4 影響老年糖尿病患者并發骨質疏松的相關因素 將單因素分析中差異有統計學意義的BMI、HbA1c、25(OH)D3、PTH、β-CTX、BGP、PINP 以 及miR-96為自變量，以老年糖尿病患者發生骨質疏松為因變量(骨質疏松=1，正常或低骨量=0)，納入多因素Logistic 回歸分析，采用逐步后退法，結果顯示，miR-96、β-CTX、BGP、BMI、25(OH)D3、HbA1c、PINP、PTH 均是老年糖尿病患者發生骨質疏松的相關影響因素(P＜0.05)，見表3。

表3 影響老年糖尿病患者并發骨質疏松的相關因素的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of the related factors affecting osteoporosis in elderly patients with diabetes

2.5 血清外泌體miR-96表達水平診斷骨質疏松的效能 經ROC 分析結果顯示，血清外泌體中miR-96 診斷老年糖尿病患者并發骨質疏松的曲線下面積為0.878(95%CI：0.828～0.927)，取截斷值為1.22，該值對應的敏感度和特異度分別為84.30%、75.60%，見圖1。

圖1 血清外泌體miR-96表達水平診斷骨質疏松的ROCFigure 1 ROC of serum exosome miR-96 expression in the diagnosis of osteoporosis

3 討論

2型糖尿病是一種常見的慢性代謝疾病，據統計，僅在2019 年，因該病死亡的人數就超過150 萬人，然而隨著現代生活方式、飲食結構等不斷改變，2型糖尿病發病率仍在持續增加[11]。骨質疏松是糖尿病患者一種常見的并發癥，糖尿病患者若發生骨質疏松，不僅增加臨床治療難度，還會增加病理性骨折風險，嚴重影響患者生活質量[12]。然而，糖尿病患者發生骨質疏松的具體病理機制尚不清楚，可能與機體長期處于胰島素抵抗狀態、高血糖狀態、糖脂代謝、晚期糖基化產物的累積、骨代謝等因素的共同作用有關[13]。因此，急需解析糖尿病患者發生骨質疏松的分子機制，以期為臨床治療提供參考。

外泌體是細胞分泌的一種細胞外囊泡，參與發育、衰老、代謝調節、壓力、運動等一系列正常生理過程。據報道，由成骨細胞、骨細胞、內皮細胞、破骨細胞、間充質干細胞細胞釋放的外泌體與骨重建過程密切相關，且具有高穩定性、無免疫原性及靶向能力強等特點[5]。眾所周知，外泌體中含有多種生物活性成分，如miRNA、mRNA、蛋白質等，并參與蛋白及核酸運輸、免疫應答等生理過程[14]。其中，外泌體中豐富的miRNA也參與骨骼代謝過程。例如，骨髓間充質干細胞(BMSCs)分泌的外泌體能夠促進成骨細胞增殖，而細胞中的miR-935 能夠靶向并負調控信號轉導和轉錄激活因子1 表達促進成骨細胞增殖及分化[15]；在骨質疏松患者中，來源于BMSCs 的外泌體通過上調miR-424-5p表達水平，抑制成骨細胞分化[16]。值得關注的是，外泌體可保護循環miRNA免受RNA酶降解，且外泌體中miRNA 檢測簡便，可得到客觀數據，故而血清外泌體miRNA 成為一種新型疾病早期診斷標志物，具有臨床推廣性[8]。

既往研究顯示，miR-96在肺癌、肝癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中上調表達，發揮促癌基因功能[17]。近期，研究發現miR-96 參與骨代謝過程，例如Liu 等[8]研究發現，miR-96 在老年骨質疏松患者血清以及BMSCs中上調表達，miR-96通過靶向抑制osterix參與成骨分化。另有研究顯示，miR-96的過表達通過激活Wnt信號通路，促進強直性脊柱炎小鼠的成骨細胞分化和骨形成[18]。本研究中，老年糖尿病合并骨質疏松患者的血清外泌體miR-96 表達水平顯著高于非骨質疏松者，與既往研究相似，說明miR-96 表達與老年糖尿病患者發生骨質疏松有關，參與骨質疏松的發生、發展。本研究多因素Logistic 回歸顯示，miR-96 是影響老年糖尿病骨質疏松的影響因素，提示監測血清外泌體miR-96 表達變化能夠反映老年糖尿病患者是否合并骨質疏松，miR-96 有作為臨床血清診斷標志物潛能。吳冠瑾等[19]研究顯示，卒中后認知功能障礙(PSCI)患者外周血miR-96表達水平升高，并通過繪制ROC 曲線發現miR-96 診斷PSCI 的曲線下面積為0.877，說明miR-96 對PSCI 有較好的診斷價值。結合本研究結果推測miR-96 在輔助診斷骨質疏松方面也有一定作用。經ROC 分析顯示，血清外泌體miR-96診斷老年糖尿病患者并發骨質疏松的曲線下面積為0.878，截斷值為1.22，敏感度為84.30%，特異度為75.60%，提示miR-96 可用于輔助臨床對老年糖尿病合并骨質疏松的診斷。

骨代謝標志物是評估機體成骨、破骨活性的重要指標[12]。本研究中使用β-CTX、BGP、PINP、25(OH)D3、PTH 反映骨代謝情況，其中β-CTX、PINP 屬于骨吸收的標志物，BGP 由成骨細胞產生，能夠激活成骨細胞并且參與調節骨吸收[20]。25(OH)D3能夠調節骨代謝及鈣磷代謝過程，促進骨骼生長。此外，PTH 不僅能夠促進破骨細胞的骨吸收，還參與調節鈣、磷代謝過程。本研究通過Pearson相關性分析發現，血清外泌體miR-96 表達水平與骨代謝指標β-CTX、BGP、PINP、25(OH)D3、PTH 以及基線資料BMI、HbA1c 均具有明顯相關性。既往研究顯示低BMI 會增加骨質疏松風險，而高HbAlc水平會影響骨重建功能，易于誘發骨質疏松[21]。以上結果表明血清外泌體miR-96 與老年糖尿病合并骨質疏松密切相關，miR-96在評估患者骨吸收等活動中具有一定作用，進一步證實通過監測血清外泌體miR-96 水平可及時動態了解老年糖尿病患者的骨代謝情況。

綜上所述，老年糖尿病并發骨質疏松患者的血清外泌體miR-96 表達水平升高，miR-96 表達變化與骨代謝指標具有明顯相關性，且與骨質疏松發生有關，miR-96 可用于臨床輔助診斷糖尿病患者并發骨質疏松。但本研究仍存在局限性，如納入病例數較少，miR-96參與骨質疏松的具體調控機制尚未明確，仍需后續開展更高質量的研究加以證實。