Penicilazaphilone C抑制NETosis誘導哮喘炎癥的機制研究

黃俊敏，王才春

海南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，海南 ?？?571199

哮喘是一類常見的慢性呼吸道疾病，全球約有3.34 億哮喘患者[1]。中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞衍生的胞外支架，由顆粒蛋白裝飾的解聚染色質組成。NETs不僅有抗感染的作用，而且對非感染性疾病也有重要影響[2]。Toussaint 等[3]發現NETs 釋放的DNA 促進鼻病毒誘導的過敏性哮喘的惡化。Pham等[4]指出NETs通過損傷氣道的上皮細胞，從而導致多種細胞(包括中性粒細胞、肥大細胞等)參與炎癥的發生，加快哮喘的進展。多數研究表明NETs與哮喘的炎癥進程相關。但針對NETosis 誘發哮喘的詳細機制及治療研究較少。Penicilazaphilone C 是從中國海南省海口市海岸的腐爛樹葉中生長的真菌Penicillium sclerotiorum分離并進行結構鑒定為新的嗜氮酮類化合物。由于該類化合物的基本結構和文獻報道的Penicilazaphilone A 和B相 同[5-6]，故 將 其 命 名 為Penicilazaphilone C (PAC)。PAC 對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等細菌有較強的抑制作用[7]。PAC具有很多生物活性，包括抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、細胞毒作用等[8]。在目前的國內外文獻中，針對PAC 的研究為數不多。本研究在PAC 抗氧化及抗炎作用的基礎上推測PAC 通過抑制中性粒細胞胞外誘捕網形成(NETosis)的產生來達到其預防或治療哮喘的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Penicilazaphilone C 由本課題研究團隊提供，化學結構見圖1。BCA蛋白定量檢測試劑盒、脂多糖、DNase Ⅰ均購自Servicebio (貨號分別為：G2026-200T、G5032-10MG、G3342-200U)。ELISA試劑盒、Triton X-100、DAPI均購自Sigma(貨號分別為：RAB0263-1KT、T8787-50ML、D9542-1MG)。

圖1 Penicilazaphilone C的化學結構Figure 1 Chemical structure of Penicilazaphilone C

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠體外誘導NETs 所有實驗均嚴格按照申請內容進行。實驗所用的30 只6～8 周齡健康雄性BALB/c 小鼠從廣州市賽柏諾生物科技公司購買，提前送到海南醫學院實驗室進行飼養。取健康小鼠新鮮外周血，用10 nmol/L 的PMA 刺激中性粒細胞。4%甲醛固定細胞，0.1% Triton X-100 通透，再用5%BSA 阻斷1 h，細胞與抗髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)抗體孵育，接著與Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔抗體孵育。對中性粒細胞培養上清液中的雙鏈DNA(dsDNA)的水平進行定量，用酶標儀來測定dsDNA 的熒光強度。PAC 由本課題研究團隊提供。設置四組PAC 的不同劑量組(0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL)，了解抑制效果，最終確定最佳有效劑量，以便進行下一步的體內實驗。

1.2.2 哮喘小鼠模型的建立 小鼠適應性喂養1 周后，根據相關研究方案[9-10]建立LPS誘導的小鼠哮喘模型(圖2)，采用LPS腹腔注射和霧化吸入的方法建立小鼠哮喘模型。把30只雄性小鼠依照數字表隨機分成五組，每組6只，即對照組、哮喘組、地塞米松組、DNase I組及PAC 組。用1 mg/mL 的LPS 與氫氧化鋁[Al(OH)3]凝膠制成混合溶液。除對照組外其他4 組在第1 天、第7 天用其腹腔注射致敏小鼠。第14～21 天，持續7 d以1 mg/mL 的LPS 氣霧劑霧化激發哮喘，30 min/d。對照組在致敏及激發階段用0.9%NaCl 溶液霧化。對于DNase Ⅰ組，霧化激發暴露前和霧化后8 h 分別霧化吸入DNase Ⅰ溶液(120 U DNase I 溶于5 mL 0.9%NaCl溶液)30 min。第21～48天，對照組和哮喘組的小鼠只接受腹腔注射0.9%NaCl溶液。在致敏及致激后，地塞米松組小鼠在第21～48 天連續4 周予2 mg/kg 地塞米松灌胃。PAC 組小鼠按照PAC 的有效劑量進行灌胃。造模結束24 h后統一處理小鼠。

圖2 LPS誘導小鼠哮喘模型實驗流程圖Figure 2 Flow chart of mouse asthma model induced by LPS

1.2.3 Western blotting 肺組織塊用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，清洗后將肺組織分成小塊進行勻漿。裂解后收集上清。取蛋白溶液，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度，上樣、電泳。用SDS-PAGE 分離細胞總蛋白提取物，并轉移到PVDF膜上，加上脫脂牛奶封閉30 min，加入配置好的一抗，4℃孵育搖床過夜。回收一抗，洗膜后加入TBST 快速洗脫，將二抗用TBST 按照1∶5 000 的比例進行稀釋，室溫下孵育30 min 后洗脫。依照說明書對CitH3 及組蛋白進行化學修飾，并使用修飾的抗CitH3抗體和抗組蛋白抗體進行檢測。

1.2.4 組織學 肺組織用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，進行HE染色、PAS染色及免疫熒光。HE和PAS染色在顯微鏡下觀察上皮細胞、炎性細胞的浸潤及黏液分泌等，并使用先前研究描述的方法對支氣管以及血管周圍的病變程度進行評分[10]。觀察到的每個支氣管評分從0 到4 分，總共評分10 個區域。評分標準：0分，沒有細胞浸潤；1分，有少許細胞浸潤；2分，有1 層細胞浸潤；3 分，有2至4 層細胞浸潤；4 分，有大量細胞(超過4 層細胞)浸潤。肺組織的整體炎癥表現以支氣管周圍和血管周圍炎癥評分的平均數來表示。肺組織切片同時進行MPO 和瓜氨酸化組蛋白H3(citrullination of histone H3，CitH3)等NETs 標志物染色。進行抗原修復及封閉。玻片上依次放入一抗及二抗，室溫孵育50 min。加DAB 顯色液，蘇木素復染細胞核。使用共聚焦顯微鏡從每個切片中隨機選擇5個區域，使用熒光顯微鏡進行成像。

1.2.5 支氣管肺泡灌洗液 對BALF當中的相關炎性細胞及細胞因子進行檢測。麻醉小鼠后，氣管插管后用PBS 沖洗肺組織3 次來獲取BALF。BALF 在4℃下離心，上清液分離，在-80℃下保存。采用ELISA 檢測白細胞介素-4 (IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-17 (IL-17)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。將BALF 離心沉淀，重懸于PBS 中，細胞計數器測定總細胞數。對于細胞比例測量，細胞懸液移至薄片機的收集孔中，并通過離心將細胞移到玻片上進行Wright/Giemsa染色。根據細胞大小、形態和細胞核形態鑒定各類細胞，計算嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、中性粒細胞在BALF中的數量。

1.2.6 NETs 各組小鼠腹主動脈采血，細胞懸液加入24 孔板中，并刺激3 h 以鑒定NETs 結構。4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100 通透，室溫下在5%BSA內封閉。加入一抗混合物(小鼠抗MPO抗體)，加入二抗混合物(兔抗CitH3 抗體)，在室溫下孵育。DNA 用DAPI 染色。用Fisher Science 的抗褪色熒光貼裝介質清洗并貼裝玻片。用熒光顯微鏡觀察圖像。為了檢測肺組織中產生的NETs，使用抗MPO 和抗組蛋白H3抗體開展免疫熒光染色。組織放置在含有甲醛的PBS 中，石蠟包埋。將切片進行脫蠟和再水化。進行抗原修復及封閉。切片依次與兔抗MPO抗體和小鼠抗組蛋白H3 抗體一同孵育。洗滌后將樣品與可識別CitH3 (驢抗小鼠IgG)和MPO 的二抗一同孵育(驢抗兔IgG)。切片及DAPI 溶液在室溫下孵育20 min，拿抗熒光衰減封片試劑來封片。用載玻片掃描儀獲得免疫熒光圖像。

1.2.7 NETs 的定量 在體外實驗中，PMA 刺激中性粒細胞4 h后，收集底層離心，收集富含dsDNA的上清液。將上清液離心，丟棄上清液，再用PBS 重懸顆粒。用SYTOX 綠板閱讀器分析NETosis。NETs 的重要成分是釋放到細胞外空間的dsDNA。PicoGreen試劑盒可以特異性地測量細胞外dsDNA，以準確反映NETs的生成。從BALF上清液中提取的dsDNA進行定量。將細胞懸液移入96 孔板中并孵育，加入QuantiT Picogreen試劑。用熒光分光光度計檢測dsDNA的熒光強度(激發波長：480 nm，發射波長：520 nm)，得到標準曲線，y=0.1 578x-0.5676，R2=0.9 987(y是DNA濃度，單位為ng/mL，x是熒光值)。將熒光值放入公式中，得到樣品的DNA濃度，從而對NETs進行定量。

1.3 統計學方法 應用GraphPad Prism 8.0 軟件對實驗數據進行分析。計量資料呈正態分布，以均數±標準差(±s)表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAC體外抑制NETosis 為了研究PAC是否在體外抑制PMA刺激的NETosis的形成，通過測定健康小鼠外周血中分離的中性粒細胞外DNA含量來實現(圖3A)。數據結果顯示，對照組所測得的dsDNA相對熒光單位為(1.43±0.47)RFU，隨著PAC劑量的增加，抑制作用也在加強。在0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL 的劑量下dsDNA 相對熒光單位分別為(0.72±0.17) RFU、(0.35±0.09) RFU、(0.16±0.02) RFU、(0.11±0.03) RFU，差異具有統計學意義(P＜0.05)。在1.2 mg/mL 的PAC 處理之后dsDNA顯著降低，表明在體外一定濃度下PAC可以有效抑制NETosis。

圖3 小鼠體內和體外dsDNA的變化情況Figure 3 The changes of dsDNA in vivo and in vitro in mice

2.2 哮喘小鼠體內存在NETs 為了確認本次實驗建立的哮喘小鼠模型中的NETs 的形成，主要通過檢測NETs 及其標志物(CitH3、MPO 和dsDNA)來實現。首先檢測BALF 中的dsDNA (圖3B)，哮喘組dsDNA水平為(300.00±8.27)ng/mL，對照組為(165.40±6.99) ng/mL，差異有統計學意義(P＜0.05)。哮喘組dsDNA 水平較對照組明顯增高。CitH3 是NETosis 的重要標志物之一，Western blotting檢測肺組織CitH3的表達(圖4A)。與對照組相比，哮喘組的CitH3 呈高表達狀態。在PAC 或DNaseI 處理后CitH3 表達明顯減弱。圖4B 中，與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織中CitH3、MPO 及其共定位明顯。DNase Ⅰ組和PAC 組小鼠肺組織中的共定位較哮喘組減少。

圖4 小鼠肺組織變化情況Figure 4 Changes of lung tissue in mice

2.3 各組小鼠BALF 中的炎癥反應 為了研究哮喘小鼠炎癥浸潤情況，對各組小鼠BALF 中的炎癥細胞和細胞因子進行了檢測(圖5、圖6)。哮喘組小鼠BALF 中有大量炎癥細胞浸潤，其中中性粒細胞所占比例大(約62%)。哮喘組小鼠BALF 中IL-4、IL-6、IL-17和TNF-α水平分別為(18.91±2.79)pg/mL、(57.09±1.70) pg/mL、(79.93±1.99) pg/mL、(31.43±3.11) pg/mL，其中IL-17顯著增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。

圖5 細胞計數器檢測各組小鼠BALF中各類細胞的數量Figure 5 The number of each type of cellin BALF of each group was detected by cell counter

圖6 小鼠體內細胞因子變化情況Figure 6 Changes of cytokines in mice

2.4 各組小鼠肺組織的改變 為了評估NETosis誘導的哮喘小鼠肺組織損傷程度，采用HE 染色和組織學評分(圖7A、7C)評價肺組織氣管和血管周圍病變情況。哮喘組肺組織可見顯著的白細胞浸潤，炎癥評分(3.17±0.75)分，提示存在多層炎性細胞浸潤，上皮細胞嚴重受損脫落。與哮喘組小鼠相比，DNase Ⅰ組和PAC 組的肺炎癥程度弱。PAC 組比DNase I組治療效果更顯著。PAS 染色觀察哮喘組肺組織大量黏液滲出，還發現了增多的杯狀細胞及膠原沉積(圖7B)。PAC 組肺組織顯示支氣管周圍的膠原沉積及杯狀細胞顯著減少。

圖7 小鼠肺組織損傷情況Figure 7 Lung tissue injury in mice

2.5 PAC體內抑制NETosis 體外細胞實驗證實了一定濃度PAC 對NETosis 有抑制作用。為了檢測PAC在體內抑制NETosis的能力，對NETs的特異性標志物MPO及CitH3進行共定位鑒定。與對照組比較，在哮喘組小鼠肺組織中，發現了大量的CitH3及MPO的空間分布。但在PAC 或DNase I 處理后，只發現了少量的共定位。與DNase I 組比，PAC 的抑制程度更顯著。再結合各組小鼠BALF的dsDNA濃度對比，以上數據表明在LPS誘導的哮喘小鼠模型中，PAC可以有效地減少NETosis的形成。

3 討論

PAC 是從海洋來源的真菌菌株分離出來的嗜氮酮類化合物，PAC 具有多種生物活性。大部分研究表明，PAC 有抗炎及抗氧化作用[7，11-13]。NETs 是由組蛋白、中性粒細胞自身DNA 及顆粒蛋白組成的網狀結構。NETs 在疾病預防中起著關鍵作用，但過量的NETs 在一定程度上會加快某些疾病的進程。PAC是否能減輕NETosis 誘導的哮喘炎癥機制尚不明確。對NETosis 相關機制進行研究具有重要意義。因此本實驗對NETosis 誘導哮喘的過程進行探究，并建立了哮喘小鼠模型，以評價PAC 在體內的平喘作用。

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特點的高度異質性疾病，其重要機制有氣道高反應性及氣道重塑[14]。研究表明在大多數哮喘患者中，糖皮質激素能夠減輕氣道炎癥，但是糖皮質激素會產生很多副作用，有骨質疏松、胃腸道刺激、出血傾向和免疫抑制等。根據氣道炎性細胞浸潤情況，哮喘被分成4種類型，即嗜酸性粒細胞型、中性粒細胞型、混合粒細胞型和少粒細胞型。將誘導痰中性粒細胞百分率＞60%的哮喘定義為中性粒細胞型哮喘。有調查表明約50%的哮喘患者屬于中性粒細胞型，中性粒細胞與重度哮喘和激素不敏感型哮喘密切相關[15]。中性粒細胞誘導相關細胞因子并延續炎癥周期，中性粒細胞和中性粒細胞衍生介質可作為慢性氣道疾病炎癥和組織損傷長期存在的原因之一。

哮喘炎癥與多種免疫驅動機制有關。目前將哮喘分為T2 型和非T2 型。Th2 介導的途徑被認為是過敏性哮喘的驅動力，即T2型哮喘[16]。T2型哮喘與嗜酸性粒細胞、IgE、IL-4 和IL-5 有關。非T2 型哮喘通常涉及中性粒細胞、IL-6、IL-17 和TNF-α[17-18]。本研究中構建的哮喘模型主要涉及IL-6、IL-17和TNF-α，其中IL-17 占絕對優勢。以Th17 細胞為主介導的哮喘稱為Th-17型哮喘或中性粒細胞型哮喘。LPS增加促炎細胞因子的釋放[19]，有研究提出LPS 能夠通過促進CD4+細胞分化為Th17 細胞，從而導致哮喘表型從嗜酸性細胞型轉變為中性粒細胞型[20]。這種轉變會造成皮質類固醇耐藥、哮喘控制不佳和病情加重。本研究對BALF 中的3 類細胞進行檢測，哮喘組嗜酸性粒細胞約占16%，中性粒細胞約占62%，證明該實驗建立的是中性粒細胞型哮喘模型。PAC 可以通過抑制NETosis的形成來減輕中性粒細胞型哮喘炎癥。糖皮質激素對NETosis 抑制作用弱，這也是部分哮喘患者對糖皮質激素的治療反應不佳的原因。

在2004 年，Brinkmann 等[21]首 次 描 述 了NETs。NETs是處在細胞外的網狀結構，是由染色質纖維所構成，上面裝飾著蛋白質和多肽，通常存在于中性粒細胞的顆粒和細胞質中。在這些蛋白中有MPO、組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶、鈣衛蛋白及溶菌酶等[22-23]。NETosis是中性粒細胞爆炸性釋放出NETs的過程，該過程是一種特殊類型的程序性細胞死亡。

多種物質可以刺激NETosis 的發生，包括PMA、LPS、IL-8 及鈣離子載體等[24]。本研究的實驗模型使用LPS誘導小鼠哮喘的發生，PMA成功刺激體外中性粒細胞產生NETs。PMA是一種植物來源的天然有機化合物，通常被用作有效的NETs 誘導劑[25]。PMA 誘導自殺性NETosis的發生，該模式以蛋白激酶C激活、細胞內鈣釋放、Raf-MEK-ERK 通路激活、NADPH 氧化酶組裝和ROS的產生為起點。過氧化氫觸發NE和MPO的激活，隨后它們從嗜天青顆粒中動員起來并移位到細胞核，促進染色質解聚[26]。同時細胞內鈣水平的增加導致PAD4的激活，PAD4參與組蛋白的瓜氨酸化，染色質解聚。隨后是核膜的解體，核質和胞質集聚，緊接著細胞膜破裂，中性粒細胞的內容物以網狀結構擴散到細胞外空間[27]。細胞外dsDNA 作為NETosis的標志物之一，生理上NETs可被血清DNA酶降解。核酸酶具有多種功能，例如控制生物膜形成或擴散、幫助某些病原體通過組織損傷侵入宿主和調節宿主免疫反應[28]。有研究評估了重組人脫氧核糖核酸酶對NETosis 的影響，結果顯示NETosis 被抑制，同時中性粒細胞的浸潤減少及炎癥減輕[29-30]。DNase Ⅰ是一種主要存在于血漿中的核酸內切酶，它作用于單鏈DNA、dsDNA 和染色質，優先以非序列特異性的方式切割DNA[29]。DNaseⅠ除了被用作分子生物學工具外，還被批準用來治療囊性纖維化?；颊咛抵写嬖贜ETs，會導致痰液黏度增加[30]。DNaseⅠ可以減少染色質解聚，并在一定程度上改變NETs 相關蛋白的溶解活性[31]。但由于DNaseⅠ在血清中的穩定性低，一定程度上限制了機體利用DNaseⅠ來抑制NETs[32]。本實驗用DNaseⅠ來處理哮喘小鼠，與PAC 組相比，多項數據表明PAC 的治療結局更好，對于NETosis，PAC具有比DNaseⅠ更好的抑制效果。

綜上所述，本研究表明NETosis 與哮喘的發病機制密切相關，同時對糖皮質激素治療中性粒細胞型哮喘缺乏有效性做出了解釋。PAC 基于其抗炎和抗氧化作用來抑制NETosis，上述結果為PAC 對哮喘的保護作用提供了新的信息。通過PAC 來抑制NETosis 的形成可能會成為減輕哮喘炎癥的一個新的治療靶點。