miR-29a-3p 抑制非小細胞肺癌增殖和遷移

朱 俊，姜 云，徐瑩瑩，劉 劍

（南通大學附屬醫院1 心胸外科；2 腫瘤化療科，江蘇 226001）

肺癌是發病率和致死率較高的惡性腫瘤之一,非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌的80%～85%[1]。盡管NSCLC 綜合治療（包括手術、放化療、免疫治療和靶向治療等）取得較快進展,但患者5年總體生存率仍然很低[2-3]。進一步探究NSCLC 生物學機制,尋找新的治療靶點具有重要意義。MicroRNA（miRNA）是一類小而短的非編碼單鏈RNA,由19～25 個核苷酸組成,通過直接與mRNA 的3'-UTR 區域結合抑制mRNA 表達[4-5]。腫瘤組織中絕大多數miRNA 是腫瘤抑制因子,但普遍受到抑制[6]。miRNA 表達水平與患者臨床參數及預后密切相關,可作為腫瘤診斷及預后的生物標志物[7]。有研究顯示,miR-383-5p 能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,可作為乳腺癌預后指標和抗腫瘤抑制劑[8]。低表達miR-335-5p、miR-155-5p、miR-146a-5p 和miR-124-3p 胃癌患者的分期更晚,腫瘤分化更差,淋巴結轉移和脈管浸潤率更高,預后更差[9]。miR-29a-3p 在淋巴細胞白血病患者血清及細胞株中表達降低,通過靶向肝癌衍生生長因子（HDGF）抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡[10]。腎透明細胞癌中miR-29a-3p 通過下調KDM5B 的表達,抑制腫瘤細胞增殖和侵襲[11]。本研究對12 例NSCLC 手術切除癌組織及癌旁正常組織進行miR-29a-3p 表達檢測,研究NSCLC 中miR-29a-3p 的表達及其對NSCLC 發生、進展的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標本 選擇2022年1月—3月我院胸外科行手術切除的12 例NSCLC 患者,均經術后病理證實,臨床分期Ⅱ～Ⅲ,其中3 例發生淋巴結轉移,術前均未進行放化療。取癌組織及距腫瘤邊緣約2 cm的正常組織。本研究獲南通大學附屬醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養與轉染 正常支氣管上皮細胞株BEAS-2B 及NSCLC 細胞株H1299 和A549（中國科學院細胞庫）用含10%胎牛血清（FBS）（Gibco,美國）的RPMI-1640 培養液（Gibco,美國）在37 ℃、5%CO2條件下培養。細胞長滿后用胰酶消化,按5×105/孔加入6 孔板,待細胞密度達80%時,根據Lipo8000TM轉染試劑（碧云天,中國）說明書操作步驟轉染陰性對照（NC）和miR-29a-3p mimics,繼續培養24 h 后進行后續實驗。

1.3 RNA 提取和RT-qPCR 檢測 采用Trizol 試劑（Invitrogen,USA）提取組織和細胞中總RNA,取1 μL RNA 樣品,One Drop 2000 超微量分光光度計測定RNA 純度及濃度。miRNA 加Poly（A）尾后,將1 μg總RNA 反轉錄為cDNA,反應程序42 ℃、50 min,85 ℃、5 min。最后,采用miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒（康為,中國）進行RT-qPCR,反應條件：預變性95 ℃、10 min,變性95 ℃、15 s,退火/延伸60 ℃、1 min,重復40 個循環。以U6 作為內參。miR-29a-3p 引物序列：上游5'-TGCGGACTGATTTCTTTTGG-3';下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6 引物序列：上游5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3';下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。采用2-ΔΔCt法計算miR-29a-3p 相對表達量。

1.4 CCK-8 細胞增殖活力檢測 H1299 和A549 細胞轉染后以每孔1×104個接種于96 孔板,于37 ℃、5%CO2條件下分別培養24 h、48 h、72 h 和96 h。根據CCK-8 試劑說明書（碧云天,中國）操作,棄去培養基,加入CCK8 試劑,37 °C 孵育1 h,于酶標儀450 nm 處測量吸光度。

1.5 EdU 細胞增殖實驗 依照BeyoClickTMEdU 試劑盒（碧云天,中國）說明書操作,H1299 和A549 細胞轉染后與50 μmol/L EdU 溶液在37 °C 下孵育2 h,4%多聚甲醛固定15 min,0.2%Triton X-100 通透10 min,在避光條件下分別用點擊反應液和Hoechst 染料孵育30 min。熒光顯微鏡（Olympus,日本）觀察并拍照,Image J 軟件計數。

1.6 劃痕實驗 H1299 和A549 細胞轉染后繼續培養24 h,用200 μL 移液器吸頭在6 孔板底部垂直劃線,顯微鏡下觀察并拍照。隨后加入含2% FBS 培養基,于37 ℃、5%CO2繼續培養,24 h 后顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J 軟件分別計算劃痕的愈合面積。

1.7 數據庫分析 我們在miRDB、RNA22、TarBase、TargetScan 4 個數據庫中分別預測miR-29a-3p 的靶基因,將這些靶基因作韋恩圖取交集,然后進行Gene Ontology（GO）富集分析,探究miR-29a-3p 可能的作用通路。

1.8 統計學處理 應用GraphPad Prism 5 統計學軟件進行數據分析及作圖。計量資料以±s表示,配對資料采用配對t 檢驗,兩組間差異性比較采用t 檢驗,三組間差異性比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NSCLC 組織及細胞中miR-29a-3p 低表達 RTqPCR 檢測顯示,與正常肺組織相比,NSCLC 組織中miR-29a-3p 表達水平顯著降低（P＜0.05）,見圖1A。H1299 和A549 細胞中miR-29a-3p 的表達水平顯著低于正常支氣管上皮細胞BEAS-2B（P＜0.05）,見圖1B。

圖1 miR-29a-3p 在NSCLC 組織及細胞中的表達

2.2 miR-29a-3p 抑制NSCLC 細胞增殖 H1299 和A549 細胞分別轉染NC 和miR-29a-3p mimics 后,RT-qPCR 檢測顯示,miR-29a-3p mimics 組較NC組miR-29a-3p 的表達量顯著增高（P＜0.01）,見圖2A,說明轉染成功。CCK8 實驗表明,miR-29a-3p mimics 組H1299 和A549 細胞的增殖活力明顯下降（P＜0.01）,見圖2B-2C。EDU 實驗也表明miR-29a-3p mimics 組H1299 和A549 細胞的增殖能力降低（P＜0.05）,見圖2D。

圖2 過表達miR-29a-3p 對NSCLC 細胞增殖的影響

2.3 miR-29a-3p 抑制NSCLC 細胞遷移 劃痕實驗結果顯示,與NC 組相比,miR-29a-3p mimics 組H1299 和A549 細胞的傷口愈合面積均顯著降低（P＜0.05）,見圖3A-B。

圖3 劃痕實驗結果

2.4 miR-29a-3p 靶基因的GO 富集分析 GO 富集分析顯示,miR-29a-3p 靶基因主要富集在細胞外基質結構成分、膠原結合、含有細胞外基質的膠原蛋白、內質網腔、外部封裝結構組織、細胞外結構組織、細胞外基質組織、多肽賴氨酸修飾等相關通路,見圖4。

圖4 預測miR-29a-3p 靶基因及GO 富集分析

3 討 論

既往研究發現,miRNA 在腫瘤細胞增殖、凋亡、轉移和腫瘤血管生成等過程中發揮重要作用,miRNA 表達模式與腫瘤類型、分期和轉移等臨床病理參數密切相關[12]。miR-451a 在NSCLC 組織和細胞系中下調,miR-451a 通過靶向調節ATF2,抑制NSCLC細胞遷移和侵襲[13];miR-485-5p 在NSCLC 中的表達下調,NSCLC 過表達可通過靶向RRM2 抑制腫瘤細胞增殖和遷移,增強順鉑的敏感性[14]。因此越來越多的研究致力于探索miRNA 作為NSCLC 生物標志物和治療靶點的價值[15]。

miR-29a-3p 在許多腫瘤發展過程中具有重要作用,如食管癌中miR-29a-3p 通過靶向VEGFA/CDC42/PAK1 信號通路抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[5];肝細胞癌中miR-29a-3p 通過靶向IGF1R 抑制腫瘤細胞增殖和遷移[16];甲狀腺癌中miR-29a-3p通過靶向OTUB2 抑制NF-κB 信號傳導,抑制腫瘤細胞生長、增殖和侵襲[17]。本研究發現NSCLC 組織及細胞系中miR-29a-3p 低表達,miR-29a-3p 能抑制NSCLC 細胞的增殖和遷移。富集分析顯示miR-29a-3p 與細胞外基質結構成分、膠原結合、含有細胞外基質的膠原蛋白、內質網腔、外部封裝結構組織,細胞外結構組織,細胞外基質組織、多肽賴氨酸修飾等相關通路密切相關。既往研究發現,人支氣管上皮細胞中miR-29a-3p 通過抑制SPARC/ERK 信號通路抑制上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,最終抑制細胞遷移[18],因此推測miR-29a-3p 抑制NSCLC 細胞遷移可能與EMT有關。

總之,本研究表明miR-29a-3p 是NSCLC 抑制因子,能抑制NSCLC 細胞增殖和遷移,其分子信號通路有待于進一步深入研究。miR-29a-3p 可能通過調節細胞外基質成分抑制NSCLC 細胞遷移。