基于代謝組學(xué)及腸道菌群探索運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生機(jī)制

陳玉容，易東平

1.海南醫(yī)學(xué)院體育部，海南海口 571199；2.重慶三峽學(xué)院體育學(xué)院，重慶 404199

運(yùn)動(dòng)性疲勞在體育學(xué)中較為常見，若未及時(shí)消除，會(huì)嚴(yán)重影響人體代謝，導(dǎo)致代謝組學(xué)發(fā)生變化，甚至誘發(fā)器質(zhì)性病變，從而威脅身心健康[1]。研究指出，相較于正常群體，運(yùn)動(dòng)員這一群體的腸道菌群有所不同，加強(qiáng)對(duì)運(yùn)動(dòng)員腸道菌群的了解，可以更好地掌握運(yùn)動(dòng)員的身體狀況，從而針對(duì)性地進(jìn)行訓(xùn)練和飲食調(diào)節(jié)，對(duì)其運(yùn)動(dòng)成績(jī)的提高有著十分積極的作用[2]。本研究為進(jìn)一步了解運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生后，人體代謝組學(xué)及腸道菌群在其中發(fā)揮的作用情況，選取海南醫(yī)學(xué)院2021年1月—年6月培養(yǎng)的24只雄性SD大鼠進(jìn)行分組對(duì)照探究，旨在為臨床提供有效的參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

①試劑藥品：甲氧胺鹽酸鹽（批號(hào)5001E07X，規(guī)格：98%），BSTFA+1% TMCS（批號(hào)60196，規(guī)格：1 g）、硬脂酸甲酯（批號(hào)J22-A，規(guī)格：99.5%）、乙腈、吡啶、正庚烷等。

②儀器設(shè)備：聚焦顯微鏡（OLYMPUS FV1000S）、各類分子生物設(shè)備（型熒光定量PCR儀，ABIPrism7900）、圖像分析系統(tǒng)（顯微鏡及Axioson分析軟件，OLYMPUS BX500）、高效液相色譜、電泳及雙向電泳裝置、凝膠成像系統(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)、超低溫冰箱、紫外/可見分光光度計(jì)、全自動(dòng)臺(tái)式滅菌儀、無菌室和超凈工作臺(tái)。

③動(dòng)物模型制備：海南醫(yī)學(xué)院培養(yǎng)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量100~150 g，經(jīng)隨機(jī)數(shù)表法分為空白組和運(yùn)動(dòng)組，各12只。空白組平均體質(zhì)量（123.21±12.36）g，運(yùn)動(dòng)組平均體質(zhì)量（124.05±12.75）g。兩組各項(xiàng)資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。對(duì)運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行遞增負(fù)荷訓(xùn)練（炮臺(tái)坡度0°），持續(xù)6 d，最后1 d為力竭訓(xùn)練，見表1。

表1 遞增負(fù)荷訓(xùn)練表

1.2 方法

①檢測(cè)指標(biāo)：采集心尖部血液5 mL，將其保存至4℃冰箱待測(cè)。將心臟組織予以漂洗，置于4℃冰箱待測(cè)。檢測(cè)血乳酸脫氫酶、肝糖原、肌糖原、肌酸激酶、血清尿素氮各疲勞指標(biāo)，標(biāo)本采集后離心處理分離血清并保存待檢，本次檢測(cè)的儀器設(shè)備為全自動(dòng)生化分析儀（日立7600-020型）。

②樣本采集：采集空白組與運(yùn)動(dòng)組樣本，收集尿液50 mL，尿液樣本采集后，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃保存；新鮮糞便樣本，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃保存；新鮮全血樣本，大鼠腹主動(dòng)脈采血2~5 mL，收集于標(biāo)記后的EDTA抗凝管中，采集后的血液保存至-80℃冰箱（實(shí)驗(yàn)中用到的為全血樣本）。

③代謝組學(xué)分析：樣本數(shù)量的篩選按照80%原則，內(nèi)標(biāo)實(shí)行歸一化，得到可視化矩陣，這個(gè)矩陣包含有樣品名、峰面積、m/z-RT對(duì)。正離子模式下共得到573個(gè)features，在負(fù)離子模式下共得到174個(gè)features。實(shí)施中心化及Pareto標(biāo)度化，而后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

④菌群與代謝物相關(guān)性分析：采用spearman分析法對(duì)存在顯著差異的代謝組學(xué)指標(biāo)和腸道菌群進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組疲勞指標(biāo)[血乳酸脫氫酶（lactate dehy?drogenase, LD）、肝糖原、肌糖原、肌酸激酶（creatine kinase, CK）、血 清 尿 素 氮（serum urea nitrogen,BUN）]，尿液代謝物3-丁二醇、3-氨基異丁酸、檸檬酸、尿酸，糞便代謝物3-氨基異丁酸、戊糖醇、檸檬酸、D-葡萄糖酸、尿酸，以及大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌各腸道菌群。比較代謝組學(xué)指標(biāo)與腸道菌群的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠疲勞指標(biāo)比較

運(yùn)動(dòng)組LD、肝糖原、肌糖原、CK、BUN水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 兩組大鼠疲勞指標(biāo)比較(±s)

表1 兩組大鼠疲勞指標(biāo)比較(±s)

組別空白組（n=12）運(yùn)動(dòng)組（n=12）t值P值LD（U/L）212.32±26.78 458.97±54.60 14.050<0.001肝糖原（mmol/L）21.26±6.45 69.82±9.87 14.267<0.001肌糖原（mmol/L）15.68±3.64 38.97±6.21 11.208<0.001 CK（U/L）154.78±12.03 318.70±25.96 19.846<0.001 BUN（mmol/L）5.05±1.14 12.36±3.25 7.352<0.001

2.2 兩組大鼠代謝組學(xué)指標(biāo)比較

運(yùn)動(dòng)組尿液代謝物3-丁二醇、3-氨基異丁酸、檸檬酸、尿酸水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。運(yùn)動(dòng)組糞便代謝物3-氨基異丁酸、戊糖醇、檸檬酸、D-葡萄糖酸、尿酸均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 兩組大鼠代謝組學(xué)指標(biāo)比較(±s)

表2 兩組大鼠代謝組學(xué)指標(biāo)比較(±s)

類型尿液糞便指標(biāo)3-丁二醇3-氨基異丁酸檸檬酸尿酸3-氨基異丁酸戊糖醇檸檬酸D-葡萄糖酸尿酸空白組（n=12）5.46±0.87 7.59±1.61 12.30±3.87 15.68±3.14 6.52±0.94 6.02±1.54 11.63±2.98 4.12±0.54 14.19±2.37運(yùn)動(dòng)組（n=12）7.48±1.20 9.55±2.64 15.86±4.41 20.03±4.68 9.85±1.67 8.79±2.03 14.47±3.60 5.68±0.68 16.89±3.68 t值4.032 2.196 2.102 2.674 6.019 3.766 2.105 6.223 2.137 P值<0.001 0.039 0.047 0.014<0.001 0.001 0.047<0.001 0.044

2.3 兩組大鼠腸道菌群比較

運(yùn)動(dòng)組大腸埃希菌、葡萄球菌水平低于空白組，乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌水平高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 兩組大鼠腸道菌群比較(±s)

表3 兩組大鼠腸道菌群比較(±s)

組別空白組（n=12）運(yùn)動(dòng)組（n=12）t值P值大腸埃希菌7.87±0.95 7.02±0.87 2.286 0.032雙歧桿菌7.71±0.86 8.90±0.94 3.236 0.004乳酸桿菌7.58±0.90 8.42±0.96 2.211 0.038大腸桿菌6.03±0.65 7.49±0.96 4.362<0.001葡萄球菌8.76±1.01 7.84±0.92 2.333 0.029

2.4 代謝組學(xué)指標(biāo)與腸道菌群的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，尿液、糞便差異代謝物與大腸埃希菌、葡萄球菌呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌呈正相關(guān)（P<0.05），見表4。

表4 代謝組學(xué)指標(biāo)與腸道菌群的相關(guān)性

3 討論

1982年第五屆國際運(yùn)動(dòng)生化學(xué)術(shù)會(huì)議上將“運(yùn)動(dòng)性疲勞”正式定義為“身體機(jī)能的生理過程不能持續(xù)在特定水平和/或整體不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”[3-4]。運(yùn)動(dòng)性疲勞屬于應(yīng)激反應(yīng)的一種具體表現(xiàn)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)造成影響，易引發(fā)缺血缺氧性損害[5-6]。迄今，關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制較多，其中能量消耗學(xué)說、保護(hù)性抑制學(xué)說、代謝產(chǎn)物堵塞學(xué)說、突變理論、疲勞鏈學(xué)說等較為常見[7-8]。但無論是哪一種學(xué)說，運(yùn)動(dòng)性疲勞的機(jī)制是非常復(fù)雜的。

既往研究表明，代謝產(chǎn)物的變化是對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行有效運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控的必要條件之一[9]。代謝組學(xué)應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練監(jiān)控中，是通過檢測(cè)機(jī)體特異的小分子代謝物質(zhì)，評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)員身體機(jī)能代謝調(diào)控狀況[10-11]。腸道微生態(tài)系統(tǒng)在人體生理功能的發(fā)揮中扮演著非常重要的角色，在物質(zhì)代謝、黏膜屏障形成、免疫系統(tǒng)發(fā)揮等方面作用顯著[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，相較于其他群體，運(yùn)動(dòng)員的腸道菌群更明顯且更廣泛，加強(qiáng)對(duì)運(yùn)動(dòng)員和腸道菌群相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行探究，可以更好地了解運(yùn)動(dòng)員的訓(xùn)練情況，為飲食的調(diào)整提供指導(dǎo)[13]。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)組尿液代謝物3-丁二醇、3-氨基異丁酸、檸檬酸、尿酸分別為（7.48±1.20）、（9.55±2.64）、（15.86±4.41）、（20.03±4.68），均高于空白組（P<0.05）；運(yùn)動(dòng)組糞便代謝物3-氨基異丁酸、戊糖醇、檸檬酸、D-葡萄糖酸、尿酸分別為（9.85±1.67）、（8.79±2.03）、（14.47±3.60）、（5.68±0.68）、（16.89±3.68），均高于空白組（P<0.05），說明相較于非運(yùn)動(dòng)大鼠，運(yùn)動(dòng)大鼠代謝速度更快，由此引起各指標(biāo)的差異，這與臨床相關(guān)報(bào)道類似。在馬海峰等[13]研究中，針對(duì)中長跑運(yùn)動(dòng)員的尿液代謝組學(xué)特征進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丁酸、異丁酸濃度等在訓(xùn)練后均有較為明顯的升高。運(yùn)動(dòng)組大腸埃希菌、葡萄球菌水平分別為（7.02±0.87）、（7.84±0.92），均低于空白組，乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌水平分別為（8.90±0.94）、（8.42±0.96）、（7.49±0.96），均 高 于空白組（P<0.05）。譚迪等[14]對(duì)運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠腸道菌群的影響進(jìn)行了分析，通過對(duì)比正常小鼠和運(yùn)動(dòng)小鼠的腸道菌群發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)小鼠的腸道菌群多樣性更強(qiáng)，其中乳酸桿菌、大腸埃希菌等保護(hù)性菌群經(jīng)測(cè)序后顯示相似度分別為100%、98%。本研究中，Spearman相關(guān)性分析顯示，尿液、糞便差異代謝物與大腸埃希菌、葡萄球菌呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），與乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌呈正相關(guān)（P<0.05），說明了人體菌群和代謝與運(yùn)動(dòng)性疲勞之間有密切關(guān)系，由此可以看出，探討運(yùn)動(dòng)性疲勞可能的發(fā)生機(jī)制，有助于為運(yùn)動(dòng)性疲勞的防治提供一個(gè)新的思路和治療方法。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生與機(jī)體代謝組學(xué)及腸道菌群的變化密切相關(guān)，加強(qiáng)對(duì)機(jī)體代謝組學(xué)及腸道菌群的監(jiān)測(cè)，對(duì)預(yù)防和減少運(yùn)動(dòng)性疲勞有著十分積極地意義。