單細胞分析技術在炎癥和衰老領域中的研究進展

侯雪冬 ，李錫勇 ，董文文，白駿恒，韓鵬飛

1.長治醫學院研究生處，山西長治 046000；2.長治醫學院附屬和平醫院乳腺科，山西長治 046000；3.長治醫學院附屬和平醫院骨科，山西長治 046000

近年來，人口老齡化領域的研究取得了一些進展，尤其在細胞衰老和炎癥方面。Baar MP等[1]和Baker DJ等[2]的研究發現清除衰老細胞可以明顯改善實驗小鼠的健康狀態和生存活力。而與此同時，單細胞測序（分析）技術應運而生，鑒于不同類型的細胞發生炎癥和衰老的模式或途徑不同，因此，將單細胞測序技術與細胞衰老和炎癥領域研究二者相融合會更加有理論依據和應用前景。

衰老及衰老相關的炎癥研究熱點更多著眼于該生物學事件的全過程，而目前單細胞測序更多的是橫向組學研究，即所有轉錄組學數據都是單一細胞水平的橫斷面數據。除Schüssler-Fiorenza RoseSM等[3]少數已使用批量轉錄組學進行單細胞測序外，仍然缺乏與衰老過程相關的單細胞水平縱向多組學研究。而鑒于在個體層面上，原則上可以從同一個體反復提取血液或組織樣本，因此，未來縱向多組學研究是可行的。另外，目前單細胞測序標本是基于不同時間點的不同物種來源的差異性個體，涉及到與衰老全過程相關的RNA轉錄表達變化缺乏時間軸上序列觀察（監測），且Bahar R等[4]和Martinez-Jimenez CP等[5]研究發現隨著年齡的增加細胞轉錄異質性也隨之增大，因此縱向多組學研究也是必要的。

在大多數情況下，單細胞測序是基于預先公布的特定標記基因來定義細胞類型的。目前，人們普遍認為細胞衰老并不意味著細胞類型的改變，而是與年齡相關的特定細胞類型的狀態變化，尤其是生物學功能方面的退化，即細胞衰老的研究，聚焦在與細胞衰老相關標記基因的表達變化。例如，某種類型的細胞可處于“早期”或“晚期”以及“部分”或“完全”狀態。此外，結合細胞結局（死亡、發病和/或功能障礙）和組學數據可以選定預測衰老相關結局的生物標志物。

1 細胞衰老與炎癥

最早關于細胞衰老的研究是Hayflick L等[6]1961開展的，其研究結果發現人類二倍體成纖維細胞在培養過程中具有有限的復制潛能，隨后細胞進入不可逆的復制停滯狀態。而Harley CB等[7]認為這種細胞分裂的復制性衰老現象與端粒DNA的不斷丟失有關。由于DNA聚合酶具有5′->3′方向性，復制機制不能復制線性染色體的末端，因此，隨著時間的推移，DNA的丟失最終會觸發細胞周期檢查點，阻止細胞進一步分裂。這種復制性衰老，也被R?hme D[8]稱為海弗利克極限，存在于許多物種中，并認為其與最長壽命相關，并由Harley CB等[7]總結為衰老的端粒理論。

然而，近年來，除端粒磨損作為誘導細胞衰老的機制之外，Campisi J[9]和 Coppé JP 等[10]還發現各種類型的應激，包括活性氧、輻射、DNA損傷劑和未折疊蛋白反應都參與了細胞衰老的誘導過程[9-10]。因此，McHugh D等[11]認為細胞衰老是細胞的一種特殊應激反應狀態，伴隨著廣泛的細胞形態和生化改變。另外，衰老細胞經常分泌細胞因子、生長因子和基質金屬蛋白酶的炎癥混合物，形成所謂的衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。這種旁分泌信號進而產生組織重塑、慢性炎癥甚至腫瘤發生等一系列負面影響。

衰老細胞是復制停滯但存在分泌表型、應激反應和代謝改變的一些細胞。用于鑒定細胞衰老的關鍵標志物是β-半乳糖苷酶 和p16（CDKN2A）或p21（CDKN1A），后者在大多數衰老細胞中表達。

2 單細胞測序

2009年首次實現單細胞的全轉錄組測序，此后，單細胞測序技術發展迅速，從僅對人工挑選的單個細胞進行測序，發展到對數十萬個細胞進行大規模多重測序，目前，單細胞測序已經成為一種成熟且可獲得的技術，涉及單個細胞的整個基因組、轉錄組或表觀基因組等多個領域。此外，隨著測序協議的出現，單細胞測序數據分析方法也迅速興起。目前可用于單細胞測序數據分析的工具資源已多達630多種。雖然在某些情況下，一套預定義的工具和參數可以提高單細胞測序的分析速度和數據的可重復性。然而，由于分析工具和計算方法的數量龐大，單細胞測序分析仍處于快速發展中。值得慶幸的是，單細胞測序工作流程的每個步驟均已進行了基準研究，因此，可根據項目需求選擇性使用。

3 細胞衰老的單細胞分析

3.1 多組織研究

Tabula Muris Consortium[12]在小鼠體內進行多組織研究，選取了6個時間點的18個組織，1~30月，報告了約53萬個基因表達。值得注意的是，在老年小鼠中，表達衰老標記物p16（CDKN2A）的細胞比例增加了一倍。Zhang W等[13]隨后對這些數據進行了分析，指出包括 Ubq、App、Ctnnb1、Mapk1、Rac1、Arf1和Junb等在內的20個“衰老基因”，其表達在超過50%的細胞類型中隨年齡增加而顯著變化，故認為其與細胞衰老有關。其中Ubq是唯一具有良好特征的基因，這表明蛋白質穩態在小鼠衰老中發揮重要作用。另外，在信號轉導通路水平上，mTOR通路被發現顯著下調，這與衰老細胞轉錄下調的總體趨勢相匹配。

而Kimmel JC等[14]研究，分析了幼齡（7月齡）和老齡（21月齡）小鼠的約55 000個單細胞，分別來自肺、腎和脾臟。研究發現，與年齡相關的基因表達變化在很大程度上是細胞類型特異性的，而較少依賴于組織類型。此外，也發現了大約200個基因在5種以上的細胞類型中有不同水平的表達。這些基因優先參與蛋白質運輸到內質網及炎癥發生過程。

3.2 單組織研究

相關學者研究數據顯示，與年輕小鼠相比，研究了10個衰老相關基因，這些基因在更多老年小鼠細胞中表達，尤其是在肝臟的庫普弗細胞中。而Franceschi C等[15]的研究則發現幾乎100%的庫普弗細胞中都存在于老年小鼠中，但在年輕小鼠的這些細胞中僅有37%出現。庫普弗細胞是常駐肝臟的巨噬細胞，衰老的庫普弗細胞吞噬和自噬能力降低，并表現出促進炎癥的炎癥表型增加。尤其是白細胞介素-1b（interleukin 1b, IL-1b），它是一種參與炎癥的細胞因子，也是衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）的組成部分。此外，Elyahu Y等[16]發現在酒精性脂肪性肝炎的情況下，IL-1b與肝臟炎癥和細胞衰老有關。

3.2.1 血液和動脈 由于血液標本易于獲取，故首先被應用于單細胞測序研究中。相關學者通過研究幼齡（3月齡）和老齡（21月齡）小鼠在接受體外免疫刺激前后1 500個幼稚CD4+T細胞的轉錄模式發現，與幼齡小鼠相比，老齡小鼠參與免疫激活過程的基因對刺激有較低幅度反應，且表現出更大的細胞間轉錄變異性，這提示免疫衰老。而Elyahu Y等[16]在研究了幼齡和老齡小鼠中約24 000個CD4+T細胞的轉錄組后，報告了免疫衰老特征性的幼稚CD4+細胞的減少。細胞毒性、耗竭和活化的調節性T細胞由于其可表達炎性細胞因子（主要是IL-27、IFNb和IL-6），故被認為可能反映了老齡小鼠的炎癥特征，而這3種CD4+亞型在幼齡動物中卻很少觀察到。

Grover A等[17]在一項與年齡相關轉錄特征的研究時，通過對幼齡（2~3月齡）和老齡（20~25月齡）小鼠的造血干細胞（hematopoietic stem cells, HSC）進行對比分析，發現特定的“老”星狀細胞亞群的積累，血小板譜系基因表達上調的同時，還伴隨著與年齡相關的紅細胞和淋巴樣細胞減少的現象。但是，當關鍵血小板編程因子FOG-1受損時，HSC生成淋巴樣細胞能力卻可以得到恢復。

Elyada E等[18]在單細胞水平上研究了幼齡（6歲）和老齡（20歲）食蟹猴主動脈和冠狀動脈的差異。他們檢測了近8 000個內皮細胞，平均每個細胞識別出了3 100個基因，其中有515個基因表達下調，259個基因表達上調，并且通過生物信息學分析，發現FOXO3A是動脈老化的關鍵調控因子。

3.2.2 胰腺 研究顯示，細胞衰老與胰腺導管腺癌（pancreatic duct adenocarcinoma, PDAC）和糖尿?。?型和2型）的發展和治療有關。相關學者在研究胰腺衰老標志物時發現，與年輕供體相比，在老年供體胰腺細胞中存在更高比例的p16（CDKN2A），并推測衰老胰腺中衰老細胞的比例增加，但由于細胞外基質存在，可能會阻止旁分泌作用，因此衰老細胞周圍的正常細胞不會受到影響。

Elyada E等[18]對PDAC中涉及的癌癥相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）進行了詳細研究，認為CAFs通過修飾膠原交聯、分泌多種細胞因子（諸如趨化因子和生長因子）以及招募免疫抑制細胞來促進腫瘤生長，而?zdemir BC等[19]和Rhim AD等[20]研究顯示CAFs實際上限制了腫瘤的生長。Elyada E等[18]在另一項對人類和小鼠胰腺細胞進行的單細胞研究中，表明CAFs實際上是由不同亞型組成的異質細胞群，例如肌成纖維細胞CAF（myCAF）、炎癥性CAF（iCAF）和抗原呈遞CAF（ap?CAF）。其中，iCAF與炎癥和細胞衰老密切相關，其表達的白細胞介素和細胞因子也具有SASP特征。

為了研究胰島衰老細胞如何參與人類和非肥胖糖尿病（non-obese diabetic, NOD）小鼠模型的1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D）的發展，Thompson PJ等[21]對8、14和16周齡NOD小鼠的21 000個細胞進行了單細胞scRNA-seq測序。他們發現β細胞成熟標記物Ucn3在該簇中被發現耗盡，且通過去除抗衰老化合物（BCL-2抑制劑）可以防止NOD小鼠出現T1D，這表明免疫系統在T1D的情況下無法清除衰老細胞，因此認為衰老可作為T1D的一種治療措施。

3.2.3 大腦 Ximerakis M等[22]在對幼齡和老齡小鼠的腦組織大約50 000個細胞的單細胞轉錄組學進行了研究，通過差異基因表達分析發現，在許多細胞類型中，選定的轉錄基因組的表達變異系數在年輕細胞和衰老細胞之間存在差異，但是在大多數腦細胞類型中，衰老和衰老相關的通路上調的同時，核糖體蛋白的轉錄似乎也都是上調的。

而Kiss T等[23]研究描述了老齡小鼠大腦微血管內皮細胞功能失調，可以導致血管性認知障礙和阿爾茨海默病等疾病。他們通過離心、過濾和分離從小鼠中提取和消化的腦組織，選定表達模式和預先編制的衰老標志物列表（如CDKN2A和Bmi1）聚類鑒定衰老的腦微血管內皮細胞，發現約10%腦微血管內皮細胞和小膠質細胞發生細胞衰老（相當于75歲人類的生物學改變）。

小膠質細胞，即大腦中的巨噬細胞，根據體外刺激方法，它們被分為靜息型、M1促炎型和M2抗炎型。Hammond TR等[24]進行了小鼠腦小膠質細胞從胚胎發育到老齡的單細胞轉錄組學研究。他們發現，小膠質細胞亞群在衰老過程中異質性增加。一些衰老的小膠質細胞表達Ccl4趨化因子且被認為與炎癥相關。

3.2.4 肺臟 Angelidis I等[25]對幼齡（3月齡）和老齡（24月齡）動物的約15 000個肺細胞進行了測序，并確定了30種不同的細胞類型。通過單細胞scRNA-seq與蛋白組學相結合，試圖在基因轉錄組和蛋白質組水平上發現折疊變化之間的顯著相關性，如Ⅳ型膠原mRNA水平呈年齡相關性下降，但蛋白水平卻呈年齡相關性上升趨勢。

正如Enge M等[26]通過富集分析發現某些細胞類型中膽固醇的生物合成增加一樣，他們觀察到慢性炎癥，并且認為氣道上皮細胞的相對頻率改變是肺衰老的標志，并進一步推測脂質穩態的失調和上皮細胞衰老有關。而Reyfman PA等[27]基于對不同年齡的8名健康供體和8例肺纖維化患者的約76 000個單細胞進行分析，發現在源自纖維化肺組織的肺泡Ⅱ型干細胞群體中，復制性衰老的1 311基因特征得分最高。

3.2.5 皮膚 Solé-Boldo L等[28]從男性供體受陽光保護的腹股溝皮膚區域收集15 000多個皮膚細胞，并在樣本中發現了14種已知細胞類型，其中，他們根據聚類（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding,t-SNE）圖和GO術語富集分析識別出4種成纖維細胞亞型（包括分泌性乳頭狀成纖維細胞、分泌性網狀成纖維細胞、間充質成纖維細胞和促炎成纖維細胞）。此外，他們比較了年輕與老年捐贈者的樣本，以研究年齡依賴性變化，揭示成纖維細胞具有一組特定亞型的“皮膚衰老相關分泌蛋白”（skin-aging associated secreted proteins, SAASP），這與之相關學者的研究結果保持一致。但值得注意的是，研究皮膚衰老過程必須特別小心，因為人類暴露在陽光下的“光老化”會強烈影響衰老相關過程，這成為研究的主要混雜因素。

3.2.6 肌肉 Hernando-Herraez I等[29]在使用來自幼齡（2月齡）和老齡（25月齡）小鼠的377個單肌肉干細胞同時，根據標記Pax7對細胞進行分類，并檢測相同細胞中的轉錄組和DNA甲基化。他們發現在幼齡小鼠和老齡小鼠的轉錄組和蛋白質組水平的異質性增加。在單細胞水平上，啟動子區域的甲基化程度與基因表達之間呈負相關。

3.3 體外研究

Tang H等人報道的衰老細胞體外研究，通過培養HCA2成纖維細胞直至復制性衰老，并對來自早期、中期和晚期傳代的總共1200個細胞進行單細胞轉錄組學和端粒侵蝕研究[30]。他們還對早期傳代細胞進行輻射應激以誘導細胞過早衰老（Stress in?duced premature senescence, SIPS）并分析了其中的400個細胞。通過t-SNE的可視化分析不同傳代的細胞，發現晚期傳代衰老細胞比輻射應激誘導的衰老細胞異質性更高，并進一步證實，細胞衰老不僅在不同的細胞類型中存在差異，而且還取決于引起衰老狀態的應激源。

Aarts M等[31]采用文庫干預方法與單細胞測序相結合的方法，基于人類原代成纖維細胞（IMR90）表達的重編程因子，以利識別出最適合抑制細胞衰老的shRNA。他們鎖定得分最高的4個靶基因分別為p21、MTOR、MYOT和UBE2E1，并認為后兩者可作為肌節部分和E2泛素結合酶新的候選基因。而Banito A等[32]也報道了轉錄因子誘導的重編程應激可降低iPSC生成的效率并進一步導致細胞衰老。

綜上所述，細胞衰老標志物表達頻率和總量的增加，以及轉錄異質性增加（通常是由DNA雙鏈斷裂等損傷引起的），這些是單細胞研究揭示最常見的細胞衰老模式，伴隨著單細胞測序技術的不斷進步，將為未來衰老方面的研究提供更廣闊的應用前景和理論貢獻。