實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)妊娠晚期GBS感染的臨床價(jià)值分析

錢云芳，徐敬軒，周文俊

1.江蘇省丹陽(yáng)市婦幼保健院檢驗(yàn)科，江蘇丹陽(yáng) 212300；2.江蘇省丹陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇丹陽(yáng) 212300

B族鏈球菌（group B streptococcal, GBS）屬于寄生在生殖系統(tǒng)、下消化系統(tǒng)的常見致病菌，正常情況下感染風(fēng)險(xiǎn)較低，但妊娠晚期孕婦因激素分泌狀態(tài)異常，可導(dǎo)致局部微生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生變化，進(jìn)而誘發(fā)孕晚期GBS感染[1-2]。GBS感染可造成早產(chǎn)、胎膜早破、宮內(nèi)感染、新生兒感染等多種不良妊娠結(jié)局，對(duì)產(chǎn)婦以及新生兒的健康均存在一定不利影響[3-4]。傳統(tǒng)檢測(cè)GBS感染多予微生物培養(yǎng)的方式檢查，但準(zhǔn)確率不理想，檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，隨著檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（poly?merase chain reaction, PCR）技術(shù)在妊娠晚期GBS感染的診斷中也有了較多應(yīng)用[5-6]。為驗(yàn)證該檢測(cè)技術(shù)的價(jià)值，本文選取2021年1—12月江蘇省丹陽(yáng)市婦幼保健院接收的180例妊娠晚期孕婦為研究對(duì)象，以基因測(cè)序法為金標(biāo)準(zhǔn)，分析了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的診斷效能以及不良妊娠結(jié)局，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇本院接收的180例妊娠晚期孕婦為研究對(duì)象。年齡20~38歲，平均（27.95±2.16）歲；孕周32~38周，平均（35.40±1.07）周；初產(chǎn)婦114例，經(jīng)產(chǎn)婦66例；基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，GBS感染陽(yáng)性14例，陰性166例。本研究已申報(bào)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：孕婦均處于孕晚期；均為單胎；近期未予抗生素治療；未使用洗液、栓劑等；無(wú)妊娠期特殊疾病；孕婦及家屬知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：采集標(biāo)本質(zhì)量差者；合并滴蟲性陰道炎者；黏液性宮頸炎者；已明確不良妊娠者；不同意本研究者。

1.3 方法

所有受試者均常規(guī)開展實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。使用B族鏈球菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）[泰普生物科學(xué)（中國(guó)）有限公司，國(guó)械注準(zhǔn)20153400272]。先清潔外陰分泌物，使用無(wú)菌窺陰器暴露患者陰道，而后使用無(wú)菌拭子置入陰道下1/3位置，旋轉(zhuǎn)1周，采集陰道分泌物，保存在無(wú)菌套管中待檢。另將無(wú)菌拭子置入肛門括約肌上2~3 cm位置旋轉(zhuǎn)，采集直腸分泌物，裝入無(wú)菌套管中。對(duì)所有檢測(cè)標(biāo)本先使用1 mL無(wú)菌氯化鈉注射液混合震蕩10 min，擠干拭子，而后移放標(biāo)本懸液。13 000 r/min進(jìn)行離心，時(shí)間10 min，取出上層清液，再以1 mL氯化鈉注射液與沉淀物混合，繼續(xù)離心10 min，采集沉淀物，加入DNA提取液。混勻后，放在99~100℃環(huán)境中加熱，加熱時(shí)間10 min，再離心10 min。取PCR反應(yīng)液35 μl至反應(yīng)管，并加入樣本的上層清液5 μl，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，尿嘧啶N糖基化酶（uracil N gycosylase, UNG）反應(yīng)。50℃2 min；預(yù)變性，95℃ 5 min；PCR，95℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)。60℃時(shí)，檢測(cè)FAM、HEX通道熒光信號(hào)，選擇反應(yīng)體系40 μl。采用PCR儀分析軟件獲得Ct值，如≤23，且對(duì)數(shù)增長(zhǎng)曲線良好，提示為陽(yáng)性?；驕y(cè)序檢測(cè)時(shí)，根據(jù)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心比對(duì)編碼CAMP蛋白序列以及標(biāo)本中的基因序列分析結(jié)果判定，如都存在GBS特有基因序列，則為陽(yáng)性。

1.4 觀察指標(biāo)

①以基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的診斷效能，包括該技術(shù)診斷孕晚期GBS感染的準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度，并分析該技術(shù)與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性。②根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果分組，比較陽(yáng)性組與陰性組產(chǎn)婦不良結(jié)局發(fā)生率，包括早產(chǎn)、胎膜早破、宮內(nèi)感染、胎兒窘迫。③比較陽(yáng)性組與陰性組新生兒不良事件發(fā)生率，包括新生兒窒息、新生兒感染、低體重兒、新生兒肺炎。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，一致性予Kappa檢驗(yàn)，Kappa>0.75表示一致性較好。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)診斷孕晚期GBS感染的效能分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢查診斷孕晚期GBS感染的準(zhǔn)確率為99.44%（179/180）、靈敏度為92.86%（13/14）、特異度為100.00%（166/166），與金標(biāo)準(zhǔn)比較一致性較好（Kappa=0.96）。見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)診斷孕晚期GBS感染的效能分析

2.2 兩組產(chǎn)婦不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較

陽(yáng)性組早產(chǎn)、胎膜早破、宮內(nèi)感染、胎兒窘迫發(fā)生率均高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組產(chǎn)婦不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較[n(%)]

2.3 兩組新生兒不良事件發(fā)生率比較

兩組新生兒窒息、新生兒肺炎發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；陽(yáng)性組新生兒感染、低體重兒發(fā)生率均高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

表3 兩組新生兒不良事件發(fā)生率比較[n(%)]

3 討論

GBS屬于革蘭陽(yáng)性兼性厭氧菌，妊娠期女性因孕激素、雌激素水平異常，陰道內(nèi)環(huán)境改變，糖原水平上升等因素影響，可導(dǎo)致陰道菌群失調(diào)，故而GBS感染的風(fēng)險(xiǎn)很高[7-8]。GBS感染可逆行擴(kuò)散至胎膜，在炎癥細(xì)胞作用下，導(dǎo)致胎膜蛋白分解，增加胎膜早破的風(fēng)險(xiǎn)，且可通過母嬰垂直傳播，增加陰道、子宮、新生兒感染等風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。對(duì)此有必要進(jìn)行GBS感染的早期診斷與治療，以改善母嬰結(jié)局。而在GBS感染的診斷中，傳統(tǒng)多予細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行診斷，但存在明顯缺點(diǎn)，可重復(fù)性差，陽(yáng)性檢出率低，耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性不高，容易受到操作因素的影響，故有必要探討更為可靠的診斷方案[11-12]。而采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢查時(shí)，其能夠?qū)Σ煌N屬GBS的特異性核算序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并使用熒光探針標(biāo)記，配合使用PCR儀，可在2~3 h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，檢查準(zhǔn)確率、靈敏度均較高，檢測(cè)周期短，操作簡(jiǎn)單可靠[13-15]。本研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢查診斷孕晚期GBS感染的準(zhǔn)確率為99.44%、靈敏度為92.86%、特異度為100.00%，與金標(biāo)準(zhǔn)比較一致性較好（Kappa=0.96），本研究結(jié)果證實(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)對(duì)GBS感染的診斷效能高。江平[16]研究中，實(shí)施熒光PCR篩查對(duì)診斷GBS感染的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度分別為99.55%、97.62%、99.68%，均處于較高水平，與本研究結(jié)果具有一致性。而在孕婦情況上，陽(yáng)性組早產(chǎn)、胎膜早破、宮內(nèi)感染、胎兒窘迫發(fā)生率分別為14.29%、14.29%、21.43%、21.43%，均高于陰性組（P<0.05），則說(shuō)明陽(yáng)性群體不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)更高。馬倩[17]研究中，陽(yáng)性組早產(chǎn)、胎膜早破、胎兒窘迫率分別為28.74%、26.98%、19.94%，均較陰性組高（P<0.05），與本研究結(jié)果一致。而在新生兒情況上，陽(yáng)性組新生兒感染、低體重兒發(fā)生率分別為14.29%、21.43%，均高于陰性組（P<0.05），則提示感染GBS可導(dǎo)致新生兒不良事件風(fēng)險(xiǎn)的增加。蕭君明等[18]研究中，GBS陽(yáng)性組不良結(jié)局發(fā)生率高于陰性組（12.85% vs 42.86%）（P<0.05），也證實(shí)GBS感染可增加新生兒不良事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，對(duì)妊娠晚期孕婦予實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)能有效檢出GBS感染，診斷效能較高，可為臨床預(yù)測(cè)孕婦與新生兒結(jié)局的工作開展提供依據(jù)。