茯苓提取物對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的治療作用及機(jī)制研究

廖小花，馮國丹，鐘細(xì)妹，謝家濱

廣東省深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳 518000

子宮內(nèi)膜異位癥是指內(nèi)膜細(xì)胞在子宮腔內(nèi)膜以外異位生長，是女性常見的一種疾病，雖然現(xiàn)如今還沒有闡明發(fā)病機(jī)制，有研究顯示炎癥因子與血管內(nèi)皮生長因子對(duì)子宮內(nèi)膜異位有重要影響[1-3]。茯苓提取物主要成分包含脂肪酸、多糖和酶等，茯苓提取物具有抗腫瘤、免疫、抗炎劑、抗醛固酮等功效，藥理活性較為良好，茯苓有悠久歷史，具有健脾寧心、利水滲濕等作用，能夠與多種藥物共同使用，其中有代表性的為桂枝茯苓湯。相關(guān)資料顯示，采用和茯苓提取物能夠?qū)ψ訉m內(nèi)膜異位機(jī)體進(jìn)行治療，具有良好成效[4-6]，所以本研究選擇2020年1月—2021年1月廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)的100只雌性大鼠為研究對(duì)象，分為5組，分析茯苓提取物對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠治療作用及機(jī)制的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇100只雌性成熟SD大鼠為研究對(duì)象，體質(zhì)量均在205~220 g。飼養(yǎng)溫度為22 ℃左右，做實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲食和飲水，觀察動(dòng)物體重和進(jìn)食情況，大鼠屬于SPF級(jí)大鼠。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建大鼠模型 在建模前24 h內(nèi)，給予每只大鼠0.2 mg戊酸雌二醇（國藥準(zhǔn)字J20171038∶規(guī)格：1 mg），在造模階段，采用濃度為2%的戊巴比妥鈉（國藥準(zhǔn)字H31020240），按照40 mg/kg進(jìn)行麻醉[7-9]。進(jìn)行無菌處理，選擇尿道口上端大約1 cm位置，做為切入點(diǎn)，沿著大鼠腹中線切開2 cm的縱形切口，將結(jié)扎右側(cè)子宮分離，選擇中間段位置1.5 cm處，將大鼠宮腔剪開，子宮組織選取5 mm×5 mm大小，應(yīng)用生理鹽水沖洗，在沖洗后將子宮組織以內(nèi)膜面貼向左側(cè)腹膜血管豐富位置，使用非吸收性縫合子宮組織四角，關(guān)閉大鼠腹部，手術(shù)之后3 d，為大鼠注射青霉素鈉（國藥準(zhǔn)字H45021515；規(guī)格：40萬單位），手術(shù)第10天開始，給予大鼠0.02 mg戊酸雌二醇，連續(xù)灌胃5 d。建模1個(gè)月之后，選擇動(dòng)情大鼠，進(jìn)行剖腹檢查，觀察大鼠移植的子宮內(nèi)膜體積增大，呈現(xiàn)透明形狀，內(nèi)部積聚液體，有血管形成，說明建模成功[10-12]。

1.2.2 分組處理 選取100只雌性大鼠，將大鼠分為5組，分為模型組，茯苓提取物低劑量組（0.5 g/kg）、中劑量組（1 g/kg）、高劑量組（1.5 g/kg）、生理鹽水組，每組大鼠20只，所有大鼠均在建模后給藥。治療后處死大鼠，在大鼠腹部主動(dòng)脈取血，同時(shí)需要留取腹腔積液，維持3 min離心，2 000 r/min，在-80 ℃環(huán)境下冷凍代用。使用濃度為10%的甲醛溶液（國藥準(zhǔn)字H43020198），進(jìn)行固定，固定時(shí)間為2 h，通過梯度脫水等處理，然后染色，在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)。每7 天為1個(gè)療程，治療時(shí)間為1個(gè)月。

1.2.3 ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF-α），前列腺素（prostaglandin E2, PGE2），環(huán)氧化酶（cyclooxygenase 2, COX-2） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)在各組中加入血清，顯色孵育之后，在450 nm處檢測(cè)各孔吸光值。對(duì)比實(shí)驗(yàn)大鼠TNF-α、PGE2、COX-2。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 移植病灶石蠟切片脫蠟至水，根據(jù)Tunnel試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，采用CMIAS軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子 （vascular en?dothelial growth factor, VEGF），基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)（matrix-metal proteins, MMP-9），平滑肌肌動(dòng)蛋白（smooth muscle actin, SMA-α），增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA），雌激素受體（estrogen receptor, ER）和孕激素（progesterone,PR）。

移植病灶采用常規(guī)石蠟制片，采用光鏡觀察，對(duì)比實(shí)驗(yàn)大鼠 VEGF、MMP-9、SMA-α、PCNA、ER、PR。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠TNF-α，PGE2，COX-2對(duì)比

實(shí)驗(yàn)大鼠TNF-α，PGE2，COX-2，模型組與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組與低劑量組、中劑量組、高劑量組分別進(jìn)行比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠中TNF-α，PGE2，COX-2值對(duì)比[(±s)，μg/L]

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠中TNF-α，PGE2，COX-2值對(duì)比[(±s)，μg/L]

組別模型組生理鹽水組P值/t值模型組：生理鹽水組低劑量組P值/t值模型組：低劑量組中劑量組P值/t值模型組：中劑量組高劑量組P值/t值模型組：高劑量組例數(shù)20 20 20 20 20 TNF-α 19.49±2.20 19.53±2.19 0.954/0.058 14.49±2.02<0.001/7.487 13.49±1.67<0.001/9.715 12.49±1.70<0.001/11.260 PGE2 223.49±13.28 222.98±12.67 0.902/0.124 168.49±13.28<0.001/13.097 143.49±14.28<0.001/18.347 128.49±15.30<0.001/20.971 COX-2 57.49±9.28 57.98±9.67 0.871/0.164 33.49±8.28<0.001/8.630 31.49±8.28<0.001/9.349 29.49±9.28<0.001/9.541

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠 VEGF,MMP-9,SMA-α，PCNA，ER和PR對(duì)比

實(shí)驗(yàn)大鼠VEGF,MMP-9,SMA-α，PCNA，ER和PR，模型組與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組與低劑量組、中劑量組、高劑量組分別進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠VEGF，MMP-9，SMA-α，PCNA，ER和PR對(duì)比(±s)

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠VEGF，MMP-9，SMA-α，PCNA，ER和PR對(duì)比(±s)

組別模型組生理鹽水組P值/t值模型組：生理鹽水組低劑量組P值/t值模型組：低劑量組中劑量組P值/t值模型組：中劑量組高劑量組P值/t值模型組：高劑量組例數(shù)20 20 20 20 20 VEGF（ng/L）1.35±0.19 1.30±0.20 0.423/0.811 1.20±0.12 0.005/2.985 0.21±0.02<0.001/26.685 0.20±0.02<0.001/26.919 MMP-9（kD）43.60±1.59 43.64±3.60 0.964/0.045 25.80±2.42<0.001/27.491 28.70±3.19<0.001/18.695 24.70±4.20<0.001/18.821 SMA-α（kDa）43.60±1.59 43.64±3.60 0.964/0.045 31.80±2.42<0.001/18.225 29.70±2.20<0.001/22.901 28.60±2.59<0.001/22.073 PCNA（kD）13.20±1.42 13.10±2.20 0.865/0.171 31.20±2.42<0.001/28.689 29.10±2.20<0.001/27.156 27.10±2.20<0.001/23.740 ER（kD）0.60±0.01 0.60±0.02 1.000/0.000 0.32±0.01<0.001/88.544 0.33±0.01<0.001/85.381 0.37±0.03<0.001/32.527 PR（kD）0.26±0.03 0.25±0.02 0.222/1.240 0.21±0.01<0.001/7.071 0.19±0.02<0.001/8.682 0.20±0.01<0.001/8.485

3 討論

茯苓性甘味淡，既可以健脾，同時(shí)對(duì)胃部有益，又能夠扶助正氣，治療血液運(yùn)行不暢等疾病。子宮內(nèi)膜異位在中醫(yī)角度上分析，屬于痛經(jīng)范疇，因此需要活血化瘀藥物治療。茯苓主要藥理主要取決于三萜類化合物和多糖成分。三萜類化合物結(jié)構(gòu)與醛固酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，主要作用于腎遠(yuǎn)曲小管和腎皮質(zhì)集合管，增加對(duì)Na+的重吸收和促進(jìn)K+的排泄，也作用于髓質(zhì)集合管，促進(jìn)H+的排泄，酸化尿液，茯苓提取物可能通過拮抗醛固酮而發(fā)揮利尿作用，同時(shí)三萜類化合物對(duì)吞噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞以及細(xì)胞因子等進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用，且對(duì)特異性細(xì)胞免疫具有增強(qiáng)作用，對(duì)非特異性免疫也具有調(diào)節(jié)作用，或許可能用于治療EMs，但目前并未研究茯苓提取物治療EMs作用[13-16]。在本研究中，高劑量組TNF-α低于其他4組，說明采用高劑量茯苓提取物，可以抑制TNF-a的表達(dá)，因此具有采用此藥物可以作為治療，患者子宮內(nèi)膜異位癥狀可以得到緩解。血管形成最關(guān)鍵的因子是血管內(nèi)皮生長因子，腹腔內(nèi)出現(xiàn)異位病灶需要有新血管生成，因此VEGF與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)，可以作為評(píng)價(jià)因子。在本研究中，高劑量組、中劑量組、低劑量組得到治療后VEGF值分別為（0.20±0.02）ng/L、（0.21±0.02）、（1.20±0.12）、因此，采用此藥物可以減少內(nèi)皮生長因子形成，具有一定效果。

孕激素受體占主導(dǎo)的內(nèi)膜組織隨經(jīng)血逆流進(jìn)入腹腔后，容易形成病灶的定植、侵襲和生長。孕激素抵抗是EMs發(fā)病過程的重要特點(diǎn)之一[17-19]。其結(jié)果提示在異位病灶中雌激素主要調(diào)控雌激素受體，從而表現(xiàn)為促炎和抗炎雙重作用。本次研究結(jié)果顯示，對(duì)比實(shí)驗(yàn)大鼠TNF-α，PGE2，COX-2，模型組與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。茯苓提取物治療能夠有效緩解子宮內(nèi)膜異位癥患者的各種臨床癥狀。采用茯苓提取物治療，能夠使機(jī)體各項(xiàng)炎癥因子和指標(biāo)得到緩解，有利于調(diào)節(jié)雌激素和孕激素，具有促進(jìn)抗炎的作用功效，所以能夠在臨床上得到應(yīng)用[20]。對(duì)比實(shí)驗(yàn)大鼠MMP-9,SMA-α、PCNA、ER和PR，模型組與生理鹽水組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與其他3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。姜悅航等[21]研究指出，采用茯苓多糖提取物調(diào)控小鼠炎癥，為改善小鼠病情，結(jié)果顯示茯苓多糖對(duì)TNF-α水平具有一定影響，茯苓多糖劑量的增加，小鼠TNF-α水平逐漸減少。本研究中TNF-α值為分別為模型組（19.49±2.20）μg/L、生理鹽水組（19.53±2.19）μg/L、低劑量組（14.49±2.02）μg/L、中劑量組（13.49±1.67）μg/L、高劑量組（12.49±1.70）μg/L,由此可以了解逐瘀湯也可以緩解內(nèi)膜異位癥狀，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述,茯苓提取物可以抑制炎癥因子生成，使炎癥因子表達(dá)維持正常，患者免疫耐受能力也會(huì)降低，避免病灶持續(xù)生長。采用茯苓提取物，可以調(diào)節(jié)MMP-9和VEGF的含量，使子宮內(nèi)膜異位無法繼續(xù)生長，對(duì)緩解患者病情有重要意義，可以得到廣泛應(yīng)用。