NAC對血糖波動誘導的內皮損傷的保護機制

張微 ，彭觀景，黃春，李青 ，黃云飛，李潔，周波 ，劉雅雯，李艷

1.湛江中心人民醫院內分泌科，廣東湛江 524000；2.湛江中心人民醫院肝臟外科，廣東湛江 524000；3.中國醫科大學附屬第一醫院干診科，遼寧沈陽 110000

在正常人體內，通過神經、內分泌等精細的調節，血糖會維持在一個相對穩定的范圍內，避免過度的波動，因為體內的氧化應激和炎癥反應會隨著血糖的波動而逐漸增加，而且這種危害是遠遠大于持續性高血糖的[1]。眾多的研究證實血糖波動會導致糖尿病患者大血管和微血管發生病變的風險以及死亡的危險顯著升高，并且已經明確早期的病理生理改變基礎就是內皮細胞功能障礙[2-3]。乙酰半胱氨酸具有很強的粘液溶解作用，它作為祛痰劑已經在臨床廣泛應用多年，無明顯不良反應。近年來很多基礎實驗發現N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）具有顯著的抗氧化作用。2008年1月—2009年12月本研究選取雄性Wistar大鼠24只應用間斷從靜脈輸注50%葡萄糖溶液的方式建立大鼠動物模型，同時加用抗氧化劑NAC干預，以便進一步探討NAC是否可以減輕氧化應激和炎癥反應。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性清潔度Ⅰ級的Wistar大鼠24只購于中國醫科大學實驗動物中心，體質量280~330 g，隨機分為A組（對照組）、B組（急性血糖波動組）、C組（NAC干預組1）、D組（NAC干預組2），每組6只，應用常規飼料及自由飲水[1]。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 ①NO、GSH-PX測定比色法檢測試劑盒從南京建成生物工程研究所購買。

②Elisa法檢測TNF-α、IL-6試劑盒購自晶美公司。

③應用免疫組化方法檢測誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)試劑盒及細胞凋亡TUNEL法檢測試劑盒從武漢博士德公司購買。

1.2.2 建立動物模型 所有大鼠先經過3~5 d的環境適應，然后麻醉后行頸部動靜脈插管術，實驗中應用動脈置管采血，靜脈置管輸液[4]。大鼠恢復3 d后開始輸液。

①對照組（A組），應用0.9%生理鹽水，保持血糖在5.5 mol/L左右；②急性血糖波動組（B組），通過50%葡萄糖注射液的間斷輸注，保持血糖5.5~20.0 mmol/L；③NAC干預組1（C組），持續輸入NAC（0.35 mg/kg·min）及間斷50%葡萄糖注射液輸注，血糖保持在B組水平；④NAC干預組2（D組），持續輸入 NAC（0.7 mg/kg·min）及間斷50%葡萄糖注射液輸注，血糖保持在B組水平。輸液總共48 h。

1.2.3 標本采集 輸液結束后，各組所有動物稱重，應用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）通過腹腔注射麻醉動物，迅速分離主動脈，部分主動脈稱重后與預冷的生理鹽水以1:9的比例進行混合，應用高速組織勻漿機在冰水浴中制成10%混懸液，4℃ 3 500 rpm離心10 min，取上清液-20℃冰箱保存以備檢測NO、GSH-PX、 TNF-α及IL-6。取部分組織制成蠟塊，連續切4 μm厚切片以備檢測iNOS的表達及凋亡。

1.3 觀察指標

①血糖：采用葡萄糖氧化酶電極法。

②一氧化氮（nitric oxide，NO）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）：采用比色法。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）測定：采用Elisa(Enzyme linked immunosorbent assay)法。

③用免疫組化的方法測定主動脈內iNOS的表達。

④應用TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法檢測主動脈內皮細胞的凋亡。

1.4 統計方法

采用SPSS 25.0統計學軟件處理數據，分析方法為單因素方差分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間差異比較以t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX、NO、TNF-α、IL-6的比較

B組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX水平較A組明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），NO、TNF-α、IL-6水平較A組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05），C組與D組和B組比較，差異有統計學意義（P<0.05），C組與D組和A組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 4組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX、NO、TNF-α、IL-6水平比較(±s)

表1 4組大鼠主動脈勻漿中GSH-PX、NO、TNF-α、IL-6水平比較(±s)

注：* 與A組比較P<0.05，#與B組比較P<0.05

組別A（n=6）B（n=6）C（n=6）D（n=6）GSH-PX(nmol/mgprot)10.02±1.10（6.26±0.38）*（9.89±1.06）#（9.20±1.91）#NO(μmol/L)1.11±0.14（2.83±0.48）*（1.24±0.15）#（1.16±0.18）#TNF-α(pg/mL)17.66±1.09（35.13±2.16）*（17.13±1.01）#（16.98±0.97）#IL-6 (pg/mL)9.82±0.61（20.56±3.78）*（9.33±0.55）#（9.27±0.49）#

2.2 4組大鼠主動脈勻漿中iNOS的比較結果

B組大鼠主動脈中iNOS相對表達量(0.41±0.05)較A組（0.14±0.03）明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05），C組（0.15±0.01）與D組（0.16±0.03）和B組比較差異有統計學意義（P<0.05），C組與D組和A組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1、圖2。

圖1 免疫組化檢測4組大鼠主動脈內iNOS表達

圖2 4組大鼠主動脈勻漿中iNOS表達的比較

2.3 4組主動脈內皮細胞凋亡檢測結果

B組在主動脈內皮細胞發現凋亡細胞，凋亡細胞的細胞核中有棕黃色顆粒，在其余3組中未見細胞凋亡。見圖3。

圖3 TUNEL檢測4組主動脈內皮細胞凋亡

3 討論

雖然大眾對糖尿病并不陌生，但是其實很多人并不是很了解該疾病的危害，即使是已經確診糖尿病的患者，也是只關注于血糖的控制，殊不知，糖尿病更可怕的地方就是它的并發癥，比如糖尿病腎病、糖尿病足、大血管病變和微血管病變等等，而在這些并發癥中目前研究認為心血管并發癥仍然是糖尿病患者主要的死亡原因[5-6]。從既往大量的研究中已經確認氧化應激和炎癥是血管病變的重要原因和中心環節[7-8]。

目前人們已經了解清楚血管病變的發生就是從血管內皮損傷開始的，在以往的實驗中把內皮細胞放到高糖環境中進行培養會發現細胞出現了凋亡，也就是內皮損傷[9-10]。而且，血糖的濃度波動和內皮細胞的凋亡都是息息相關的，血糖波動的危害大于持續的高血糖[1]。

人體內部是一個復雜的調節系統，在很多方面都需要保持一個平衡的狀態，如果人體內的氧化物增多，抗氧化物減少，那么就會出現氧化應激從而導致組織的損傷[11]。血糖水平的升高可激活機體內多元醇信號通路，從而消耗了機體內大量的抗氧化物比如還原型谷胱甘肽，那么相對來說氧化物比如活性氧自由基就會積累增多，導致氧化與抗氧化之間失去平衡，這種不平衡進一步導致氧化應激，血糖水平升高還會使抗氧化酶糖基化GSH-PX活性降低。本研究發現在急性血糖波動組中GSH-PX的水平明顯降低提示存在氧化與抗氧化之間平衡失調，應用抗氧化劑NAC后這種情況得到了改善，這種平衡的恢復也進一步證實了氧化應激的存在。

在人體的酶系統中NOS系統是比較重要的，在這個系統中iNOS可以催化精氨酸脫氨基產生NO，NO的眾多作用當中有一項很重要就是調節血管舒張，這種作用對維持心血管功能的穩態也非常重要，它在體內還會參與很多生理、病理的過程[12-13]。有研究對糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠進行比較會發現糖尿病小鼠的iNOS活性明顯增加，本研究的發現也一樣，血糖波動使iNOS活性增強，NO水平也出現升高。

在眾多的炎癥因子中，TNF-α和IL-6是非常經典也是非常重要的，如果檢測2型糖尿病患者的血清就會發現TNF-α和IL-6的水平是升高的，TNF-α和IL-6的作用非常廣泛，它可以促進機體內的炎癥反應，調節自身免疫，還可以增加自由基，促進活性氧簇的增多，這種變化又和氧化應激聯系起來，最終導致機體內的線粒體功能紊亂[14]。TNF-α和IL-6還可以通過調節白細胞與血管內皮細胞的粘附作用這兩種方式影響內皮功能。正如實驗結果所示應用Ellisa法在急性血糖波動組檢測IL-6水平為（20.56±3.78）pg/mL，為本實驗4組中水平最高的，和其他3組比較差異有統計學意義（P<0.05），對照組的水平只有（9.82±0.61）pg/mL，這和宋華靜等[15]的研究結果一致，宋華靜等研究血糖濃度波動對IL-6的影響時發現葡萄糖濃度波動組IL-6濃度的結果為(204.99±25.08)ρ/（ng·L），和對照組(122.41±18.19)ρ/（ng·L）比較差異有統計學意義（P<0.05）。同樣本實驗中TNF-α水平也明顯增加，可以認為血糖波動誘導了內皮細胞的炎癥反應，應用抗氧化劑NAC后這種情況可以得到改善。

綜上所述，本研究成功建立了在體血糖波動的動物模型，并進一步研究證實血糖波動能增加主動脈內皮內的炎癥和氧化應激，應用NAC后可以顯著改善炎癥和氧化應激。從本研究中也看到了血糖波動尤其是急性血糖波動的危害，本研究也為改善血糖波動的危害提供了新的治療思路。