長鏈非編碼RNA MHRT、長鏈非編碼RNA H19和NT-proBNP聯合指標在老年心力衰竭患者預后中的研究

王燕慧,李梁,陶應敏,謝娟

1. 復旦大學附屬上海市第五人民醫院全科醫學科 2. 復旦大學社區健康研究中心(籌),上海 200240

目前,慢性心力衰竭(chronic heart failure, CHF)已成為各種心血管疾病患者死亡的首要原因[1]。近年來, CHF發病率逐年增加,雖然臨床對CHF的診斷和治療已有較大進展,但死亡率仍很高,患者5年病死率達40%～50%[2]。早期的狀態評估有助于采取合理的治療方法,減少老年心衰患者的死亡率。NT-proBNP是由心室心肌細胞分泌的一類肽類激素,是反映心臟負荷的重要標志物,當機械損傷、心肌受到牽拉和心室前后負荷增大時可釋放,可評價心衰的嚴重程度和患者的預后[3]。但由于高齡、腎功能不全、肺栓塞等因素會引起NT-proBNP假性升高,因此其特異度不高[4]。

多項研究表明, CHF與自噬、炎癥反應、信號轉導、微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等相關[5-6]。LncRNA動態表達于不同細胞類型、發育階段或疾病狀態,它影響了某些疾病的發病機制及發展過程,如心血管疾病和腫瘤等[7]。MHRT是一種通過可變剪切產生的lncRNA分子,通過Brg1抑制心肌肥厚的發生,起到保護心臟作用的肌球蛋白重鏈相關RNA轉錄物,為肌球蛋白重鏈7的編碼基因[8]。且MHRT已被證明與CHF患者的生存和預后相關[9-10]。H19是一種母源性印記基因,長度為3.0 kb,轉錄本為lncRNA,進化保守性很強,在胚胎發育期表達得很豐富。Greco等[11]2016年證實,在非終末期心力衰竭患者、終末期心力衰竭患者和心肌肥厚小鼠模型中, H19都可以看到明顯的增長。該研究表明,這些指標在預測老年心力衰竭患者預后方面具有重要作用。

1 資料和方法

1.1一般資料選取2020年6月—2021年6月上海市第五人民醫院收治的CHF患者161例進行研究,其中男性82例,女性79例,年齡65～91歲,平均(76.4±7.2)歲。納入標準： (1)患者符合中國心力衰竭指南中的診斷標準[12],患者出現心力衰竭癥狀及體征;左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)降低或正常;NT-proBNP>125 ng/L; (2)美國紐約心臟病學會(NYHA)心功能Ⅱ～Ⅳ級; (3)年齡≥65歲; (4)隨訪時間18個月。排除標準： (1)近3月出現心梗、腦血管疾病及不穩定心絞痛者; (2)患有感染或炎性疾病、凝血功能不全、正進行免疫治療及自身免疫系統疾病的患者; (3)惡性腫瘤者、臟器功能不全的重癥患者; (4)患者因某種原因無法完成相關檢測工作,中斷復診。這項研究由上海市第五人民醫院醫學倫理委員會審查通過,已征得所有患者知情同意并簽字。

1.2主要試劑與儀器RNA提取試劑：TRIeasyTMLS Total RNA Extraction Reagent, yeasen公司,貨號19201ES60;逆轉錄試劑盒： PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time), TAKARA公司,貨號RR047Q;定量PCR試劑TB Green? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus), TAKARA公司,貨號RR420Q。Q-PCR儀器：ABI公司,儀器型號Vii7。

1.3研究方法人口學資料、疾病史、臨床、化驗及超聲心動圖檢查結果,于入院24 h內采集入組患者。采集心衰患者入院第2天晨起空腹靜脈血,經1 500 r/min, 4 ℃離心10 min后收集血清,-80 ℃保存待測。用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清NT-proBNP水平,為美國R&D公司生產。采用試劑盒提取血清總RNA并反轉錄得cDNA,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀擴增MHRT、 H19及其內參(U6),引物序列見表1,引物由尚亞生物公司合成。采用 2-△△CT法計算血清MHRT、 H19相對表達量。采用超聲心動圖獲取心功能指標(LVEDD、左室收縮末期內徑(LVESD)及LVEF。對所有心衰住院患者實施了規范藥物治療,并進行18個月的隨訪,在此期間沒有進行其他干預。該不良事件被定義為在18個月內因心力衰竭再次入院治療或出現心源性死亡。出院后每3個月進行一次隨訪,通過查看病史資料、門診復查和電話回訪等方式,判斷是否出現不良事件。根據CHF患者是否出現主要終點事件分為不良心血管事件[MACEs(+)]組和MACEs(-)組。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1MACEs(+)組和MACEs(-)組的臨床特征比較隨訪過程中有90例發生了主要終點事件,其中心源性死亡(28例),心衰再入院(62例);未發生主要終點事件者50例;失訪21例。MACEs(+)組的患者年齡、總膽固醇高于MACEs(-)組(P<0.05), eGFR低于MACEs(-)(P<0.05)。在性別、體質量指數(BMI)、心率、肝功能、糖化血紅蛋白方面2組差異無統計學意義。MACEs(+)組血清H19、 NT-proBNP、 LVEDD高于MACEs(-)組, MHRT、 LVEF低于MACEs(-)組,差異均有統計學意義。見表2。

2.2不同LVEF患者血清標志物濃度比較隨著LVEF降低,心功能嚴重程度的加重,心衰患者H19、 NT-proBNP水平升高, MHRT水平降低,差異均有統計學意義。見表3。

2.3血清標志物與心功能指標的相關性NT-proBNP和H19均與LVEF呈負相關(P<0.001),而MHRT則與LVEF呈正相關(P<0.001),由此可見,隨著NT-proBNP和H19水平的升高以及MHRT水平的降低,心衰患者LVEF值逐漸降低,心功能嚴重程度逐漸加重。見表4。

表2 是否發生MACEs的人群基線特征

2.4心力衰竭預后危險因素分析將NT-proBNP以300 ng/L為界、 MHRT以0.85為界、 H19以0.94為界分為2組,并均以分類變量的形式進入Cox回歸分析模型中。單因素Cox回歸分析顯示低MHRT、高NT-proBNP和高H19是發生MACEs、心衰再入院的主要危險因素(P<0.05)。多因素Cox回歸分析顯示低MHRT、高NT-proBNP和高H19與發生MACEs、心衰再入院均有關(P<0.05)。見表5。

根據危險因素MHRT<0.85、 H19>0.94和NT-proBNP>300 ng/L出現的個數進行分組,利用Kaplan-Meier曲線對不同組別的患者生存率進行比較。在心力衰竭的老年患者中,隨著危險因素的增加,患者的生存時間下降。見圖1。

圖1 不同組別患者生存情況的K-M曲線

表3 不同LVEF水平心衰患者血清標記物水平比較

表4 血清標記物與心功能指標的相關性

表5 Cox回歸分析老年心衰患者不良終點事件的危險比

2.5血清標志物對心衰預后的預測價值比較血清NT-proBNP、 MHRT及H19預測心衰預后的臨界值、靈敏度、特異度及曲線下面積見表6。NT-proBNP、 MHRT、 H19單獨預測的AUC分別為0.702、 0.716和0.755。MHRT聯合H19預測心衰預后的AUC為0.791,優于NT-proBNP聯合MHRT、 NT-proBNP聯合H19。3個指標聯合預測的AUC為0.832,效果最優。見圖2。

3 討論

在美國,超過九分之一患者的死亡是由心力衰竭引起的,大量CHF患者在確診后5年內死亡[13]。年齡愈高,心衰患者的預后愈差[14]。對心衰患者的預后做出準確的評估,能及時干預疾病的進程,選擇最佳的治療方案,減少患者的病死率,提高患者的生存質量。

LncRNA參與多種重要生理過程,如細胞分化、發育、防御反應和免疫反應等,為長度大于200個核苷酸的RNA分子[15]。LncRNA對組織、細胞類型的表達特異性比蛋白質編碼基因更強[16]。有研究發現, MHRT通過miR-3185促進心肌梗死后心肌纖維化[17]。Lie Zhang等[10]發現,CHF患者比健康人群血漿中MHRT表達降低,隨訪研究發現MHRT表達水平較低的CHF患者生存條件較MHRT表達水平較高的患者更差。另有研究發現, CHF患者血漿中MHRT的表達水平異常升高, CHF的發病風險和預后與MHRT基因rs7140721、 rs3729829、 rs3729825 SNP位點存在顯著相關性[9]。這些研究表明,心力衰竭患者對MHRT的表達在不同的研究中存在爭議。在本研究中, MACEs(+)組血清MHRT低于MACEs(-)組,多因素Cox回歸分析顯示低MHRT與發生MACEs、心衰再入院均有關。MHRT預測不良事件的AUC為0.716。

表6 血清標記物對心衰患者預后的預測價值

圖2 血清MHRT、 H19、 NT-proBNP單獨(A)及聯合(B)預測心衰患者發生MACE的ROC曲線

這與Lie Zhang等[10]的研究結果一致, CHF患者MHRT表達下調,且MHRT的特異性表達具有預后價值。

H19位于人類第11號染色體上,是心肌細胞凋亡和增殖的重要調節因子[18]。H19在小鼠衰竭心臟中被發現下調,并在豬和人的心臟中被驗證[19]。H19是心肌細胞中促衰老lncRNA,通過靶向miR-19a/ socs1/p53軸驅動心肌細胞衰老[20]。Liu等[21]證實H19高表達于肥厚心肌和心力衰竭中,在抑制心肌細胞肥大過程中, H19-miR-675軸起到重大作用。本研究證實,隨著H19水平的升高,心衰患者LVEF值逐漸降低,心功能嚴重程度逐漸加重。多因素Cox回歸分析顯示高H19是發生MACEs、心衰再入院的主要危險因素。H19單獨預測心衰患者預后的AUC為0.755,較MHRT、 NT-proBNP有更高的預測能力。另外,本研究顯示MHRT聯合H19預測心衰預后的效果優于NT-proBNP聯合MHRT、 NT-proBNP聯合H19。三者聯合預測效果最優。

NT-proBNP水平與LVEF負相關,與LVEDD正相關,表明NT-proBNP與心臟的結構、功能存在某種關聯,且MACEs(+)組的NT-proBNP高于MACEs(-)組,這與本研究之前的研究結果一致[22]。NT-proBNP單獨預測心衰患者預后的效果較差,多因子聯合檢測比NT-proBNP單獨檢測具有更高的價值,可提高預測效能。

該研究僅限于單個中心的小樣本研究,所以有一定的局限性, LncRNA未分層,隨訪時間不長,出院后指標也未進一步隨訪,評估心衰預后有局限性。這項研究結果表明,通過聯合檢測不同的反映心衰指標,有助于提高心衰患者發生主要終點事件的預測能力,仍將是未來的主要研究方向[22]。