重組禽流感病毒(H5+H7)三價滅活苗免疫抗體消長規律研究與應用*

陳建豪，買吾蘭·孜克牙，楊夷平，楊康，張國新，古麗巴哈·卡德爾，阿達來提·尤素甫，坤巴哈斯·沙合依，馬春江

（哈密市動物疫病預防控制中心，新疆 哈密 839000）

高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HPAI）是由H5和H7亞型HPAI病毒感染引起的一種禽類烈性、高度接觸性傳染病，也是人獸共患傳染病[1]，被世界衛生組織列為一類動物疫病。該病不但造成巨大的經濟損失，同時也可引起人感染HPAI而死亡，引發人們高度關注。目前世界各國預防HPAI發生的最主要手段是進行疫苗接種，我國主要采取疫苗免疫聯合撲殺感染家禽的綜合防控措施。

隨著基因工程技術如DNA重組技術、反向遺傳學技術及基因編輯技術的發展，禽流感疫苗的研發逐漸從傳統的滅活疫苗和弱毒活疫苗向基因工程疫苗過渡[2]，但從傳統來說，滅活油乳劑疫苗依舊是預防禽流感的首選疫苗，因為它免疫效果好、安全可靠[3]。選擇合適的疫苗和合理免疫程序對于HPAI的防控具有重要的意義。本試驗選取了三個廠家最新生產的重組禽流感H5+H7三價滅活苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）免疫蛋雞，通過檢測抗體效價研究HPAI免疫抗體消長規律，同時評估免疫效果，根據試驗結果篩選最合適的重組禽流感（H5+H7）三價滅活苗，優化免疫程序，為基層疫苗免疫提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

三種重組禽流感病毒H5+H7三價滅活苗疫苗均源于自治區招標采購中標廠家。禽流感（H5N1 Re-11）和禽流感（H5N1 Re-12）病毒抗原批號分別為2020001和2021003，生產廠家均為哈爾濱維科生物技術有限公司。試驗動物來自哈密轄區某蛋雞場。

1.2 試驗分組

選取18日齡左右雛雞240羽，隨機分為3組，每組80只。按照免疫方案和疫苗說明書進行免疫注射，18日齡首免，46日齡強化免疫，疫苗免疫后隨時觀察并記錄試驗動物的臨床表現。具體見表1。

表1 試驗蛋雞分組免疫表

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 分別于25、32、39、46、60、75、105、135、165日齡采集血液樣品，每個日齡每組隨機抽取30只雞，18日齡采集40份血液樣品，無菌分離血清后-20℃保存。

1.3.2 檢測方法與判定 血凝（Hemagglutination test，HA）試驗和血凝抑制（Hemagglutination inhibition test，HI）試驗根據中華人民共和國國家標準《高致病性禽流感診斷技術》（GB/T 18936-2020）規定的操作規范進行，待檢血清HI抗體滴度≥4log2時判為陽性，視為免疫抗體合格。

2 結果與分析

2.1 母源抗體檢測結果

18日齡采集40份血清樣本做母源抗體檢測，禽流感H5N1（Re-11）平均抗體效價為2.38log2，抗體合格率為20%；禽流感H5N1（Re-12）平均抗體效價為2.30log2，抗體合格率為20%；禽流感H7N9（H7-Re3）平均抗體效價為0.75log2，抗體合格率為0%。檢測結果表明，此時雞群母源抗體效價較低，不足于抵抗野毒感染。

2.2 H5N1（Re-11）檢測結果

HI抗體效價顯示，A、B、C三組在18日齡首免后一周，H5N1（Re-11）平均抗體效價均略微降低，免疫后2周抗體效價開始迅速上升，3周時抗體合格率達到90%，4周抗體效價達到高峰，平均抗體效價在7log2左右，抗體效價差異不大，變異系數最高的A組較最低的C組變異系數高2.85%。A、B、C三組在46日齡二免后二周，H5N1（Re-11）平均抗體效價達到較高水平（9log2以上），抗體合格率達到100%；75日齡時抗體效價達到峰值，隨后緩慢下降，變異系數最高的C組較最低的B組變異系數高8.18%。二免后四個月（165 d），H5N1（Re-11）平均抗體效價＞7log2。抗體檢測結果見表2。

表2 H5N1（Re-11）株平均抗體效價（log2）檢測結果

2.3 H5N1（Re-12）檢測結果

H5N1（Re-12）平均抗體效價檢測結果與H5N1（Re-12）相似。三組試驗雞在一免后4周抗體效價達到高峰，平均抗體效價在7log2左右，變異系數最高的A組較最低的B組變異系數高3.67%；二免后1個月，抗體效價達到峰值，隨后緩慢下降，變異系數最高的C組較最低的A組變異系數高3.01%；二免后四個月（165 d），H5N1（Re-12）平均抗體效價在6log2左右，B組出現單個樣品抗體效價不合格。結果見表3。

表3 H5N1（Re-12）株平均抗體效價（log2）檢測結果

2.4 H7N9（H7-Re3）檢測結果

A、B、C三組在18日齡首免后一周，H7N9（H7-Re3）平均抗體效價均略微上升，3周時抗體合格率達到93%以上，4周抗體效價達到高峰，平均抗體效價在6log2左右，變異系數最高的B組較最低的A組變異系數高0.36%。75日齡時抗體效價達到峰值，隨后緩慢下降，變異系數最高的C組較最低的A組變異系數高7.10%。二免后四個月（165 d），H7N9（H7-Re3）平均抗體效價大于7log2。檢測結果見表4。

3 討論

禽流感病毒極易通過變異和重組產生新的毒株，因其感染性和致病性強等對禽業造成嚴重危害以外，還對人類健康造成巨大的威脅。H5、H7亞型禽流感病毒已在全球60多個國家和地區引起了疫情，人感染H7N9禽流感病毒也時有報道[4-5]。接種疫苗是目前預防和控制禽流感最有效的方式之一，禽流感疫苗的使用對同種HA亞型HPAIV引起的禽流感保護力有所降低，但可有效減輕家禽養殖生產中的臨床發病癥狀，從而降低、甚至避免重大經濟損失。劉艷晶等[6]研究表明，使用與疫苗株存在抗原差異的H5N6、H7N9和H5N8亞型毒株攻毒，重組禽流感病毒（H5+H7）三價滅活疫苗（H5N1Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）免疫雞在攻毒后仍然可以獲得臨床保護，無明顯臨床癥狀，并可有效阻止大多抗原變異毒株在體內的復制。本試驗通過研究重組禽流感（H5+H7）三價滅活苗（H5N1 Re-11株+Re-12株，H7N9 H7-Re3株）疫苗免疫家禽后抗體的消長規律，評估免疫后雞群的抗體水平，為現有疫苗的應用提供基礎數據。

本試驗中HI抗體效價顯示，三組疫苗免疫雞群后的三個毒株的平均抗體效價基本趨于一致，但三組疫苗初次免疫2周后H5N1Re-11株、Re-12株和H7N9 H7-Re3株平均抗體效價（A組＞B組＞C組）差異較為顯著（P＜0.05），隨后三組疫苗免疫抗體效價快速上升，趨于一致，分析可能是疫苗佐劑等原因影響疫苗釋放有關。隨后H5N1 Re-11株、H5N1 Re-12株、H7N9 H7-Re3株在一免后28 d和二免后1個月，各組內和組間平均抗體效價差異較小，變異系數值也較低，差異不顯著（P＞0.05），抗體合格率分別為90%以上和100%。結果表明，3個廠家的重組禽流感三價疫苗均具有良好的免疫原性。

免疫程序的選擇和優化對于禽流感的防控也起到至關重要的作用。本試驗中選擇雞群18日齡首免，母源抗體監測中三個毒株的平均抗體效價均低于4log2，其中H7N9 H7-Re3株抗體效價為0，與劉婷婷等[7]蛋雞H5、H7亞型禽流感病毒母源抗體消長規律的研究基本一致，一免后一周疫苗保護效力還未形成，存在野毒感染的威脅，所以雞群的首免時間可以提前至15日齡左右。在禽流感三價滅活苗一免后28 d，此時抗體效價達到高峰，測定的H5N1 Re-11株、H5N1 Re-12株和H7N9 H7-Re3株的抗體效價均在6log2以上，產生的抗體較為均衡；二免后1個月再次升至高峰，達9log2以上，隨后緩慢下降；在二免后120 d，H5N1 Re-11株和H7N9 H7-Re3株抗體水平仍維持在7log2以上，H5N1 Re-12株抗體水平維持在5.8log2以上。結果表明，雛雞一免產生的抗體效價雖然能夠有效保護雞群，但整體的抗體效價不高，對于飼養周期較短的家禽可以免疫一次。對于飼養期較長的種禽、蛋禽，可在一免后28 d強化免疫，可保證雞群整體的抗體效價保持一個較高水平；同時建議開產前進行1次加強免疫，之后每隔6個月加強免疫一次。