管碟法測定制霉菌素效價的方法建立及應用

摘要：目的 建立適用于制霉菌素口用凝膠中制霉菌素效價測定的方法。方法" " 通過考察試驗菌株、溶劑濃度、N，N-二甲基甲酰胺、菌層體積、緩沖溶液、培養溫度、培養時間和培養基適用性等影響管碟法的因素，確定采用管碟法的二劑量法，以啤酒酵母ATCC2601為試驗菌，用制霉菌素檢定培養基（pH6.0）和磷酸鹽緩沖液（pH6.0），在30℃～32℃下培養20～24 h，對制霉菌素標準品和口用凝膠中制霉菌素的效價進行測定。結果" " 在91.71～12.29 U/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.9937），方法的專屬性、中間精密度和準確度符合要求。結論" " 該方法可用于制霉菌素口用凝膠中制霉菌素的效價測定。

關鍵詞：制霉菌素；管碟法；抑菌圈；效價

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Establishment and application of a method for the determination of nystatin

by the cylinder-plate

Shen zhen1，2， Ding bo1，2， Meng Xiao-li1，2， and Xu Xiao-jie1，2

（1 Shandong Institute for Food and Drug Control， Jinan 250101; 2 NMPA Key Laboratory for Research and

Evaluation of Generic Drugs， Ji'nan 250101）

Abstract" " Objective" " To establish a suitable method for the determination of nystatin content in nystatin oral gel. Method" " The test design and investigation on the determination of nystatin by cylinder-plate for two dosage technique were carried out with Saccharomyces cerevisiae （ATCC2601） as the test fungus， nystatin assay medium （pH 6.0）， 5%（V/V） N， N-dimethyl formamide （DMF）， sterile phosphate buffer （pH 6.0， K2HPO4 20g： KH2PO4 80g）， culture temperature at 30℃～32℃ and 20～24 h. Various factors influencing antibiotics titer such as test stains， concentration of DMF， volume of germ layer medium， phosphate buffered solution， medium suitability， culture temperature， and incubation time were examined. Results" " The method for the determination of nystatin by cylinder-plate has good linear relationship of 0.9937 in the range of 91.71～12.29 U/mL nystatin， and it has good intermediate precision， exclusivity， and accuracy. Conclusion" " "This method can be used for the detection of antibiotics in nystatin oral gel.

Key words" " Nystatin; Cylinder-plate; Bacteriostatic zone; Antibiotics titer

制霉菌素（nystatin）是38元多烯大環內酯類抗生素，于1950年由Hazen和Brown從諾爾斯鏈霉菌（Streptomyces noursei）中分離出來。研究表明，制霉菌素是一種多組分混合物，包括制霉菌素A1（nystatin A1）、制霉菌素A3（nystatin A3）和多真菌素B（polyfungin B）。由于基因型不同，不同的諾爾斯鏈霉菌菌株可以合成具有不同比例組分的制霉菌素[1-2]。

制霉菌素具廣譜抗真菌作用，通過與真菌細胞膜上的甾醇結合，改變細胞膜通透性，以致細胞內容物漏失而起到抗真菌作用。臨床上主要用于治療淺部白色假絲酵母菌感染，如消化道念珠菌病、鵝口瘡、念珠菌性陰道炎和外陰炎等，同時在聯合用藥方面也有很多應用[3]。目前開發出包括納米膠囊水凝膠、脂質體和藻酸鹽微粒等劑型以使其能夠獲得更加廣泛地應用[4]。

雖有研究報道了HPLC、HPLC-MS和紫外分光光度法進行制霉菌素定量的方法，但尚無任何標準收載[5-9]。《衛生部頒標準WS1-C2-0025-89》收載制霉素的含量測定方法參照抗生素微生物檢定法進行，而《中國藥典》2020版四部1201抗生素微生物檢定法采用管碟法和濁度法，共收載35種抗生素，但未收載制霉菌素。抗生素微生物檢定法（管碟法）系利用抗生素在瓊脂培養基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者接種的試驗菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品抗菌活性（效價）[10-12]。各國藥典和歐洲藥典也都收載了該方法[13-16]。

本文通過考察試驗菌株、溶劑濃度、菌層體積、緩沖溶液、培養溫度、培養時間和培養基適用性等影響管碟法的因素，建立制霉菌素的微生物檢定方法，進而驗證方法精密度、專屬性、線性和準確性。

1 儀器材料

1.1 儀器

Sartorius CP225D電子天平（德國賽多利斯集團）；GHP-9270恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；ZY-300IV微生物自動測量儀（北京先驅威鋒技術開發公司）；Z8抗生素效價測量儀（杭州迅數科技有限公司）。

1.2 菌種

啤酒酵母ATCC9763購于北納創聯生物技術有限公司，工作菌種為第3代。啤酒酵母ATCC2601購于山東拓普生物工程有限公司，工作菌種為第3代。

取新鮮培養的啤酒酵母制霉菌素檢定培養基斜面，用滅菌水將菌胎洗下，置含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻，備用。

1.3 培養基和試劑

蛋白胨（批號3208111）、牛肉浸粉（批號3208090）、酵母浸粉（批號3207031）、瓊脂（批號3208097）均購自廣東環凱微生物科技有限公司；葡萄糖（批號20120612）、氯化鈉（批號20170922）、磷酸氫二鉀（批號20190715）、磷酸二氫鉀（批號20190726）、N，N-二甲基甲酰胺（批號20181114）均購自國藥集團化學試劑有限公司；制霉菌素檢定培養基（批號20200217）購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司（A公司）；制霉菌素檢定培養基（批號20191220）購自山東拓普生物工程有限公司（B公司）；制霉菌素檢定培養基（批號20191218）購青島日水生物技術有限公司（C公司）。

1.4 標準品、供試品和原輔料

制霉菌素標準品（批號130375-201802）購自中國食品藥品檢定研究院；制霉菌素原料（批號4010411）購自Antibiotice S.A Iasi；羥乙基纖維素（批號R1304）購自Ashland；蔗糖（批號20190729C）購自漳州漳福糖業有限公司；甘油（批號20180621）購自南昌白云藥業有限公司；羥苯甲酯（批號20180701）購自江西阿爾法高科制藥股份有限公司；羥苯丙酯（批號110720180801）購自湖南爾康制藥股份有限公司；草莓香精（批號119679）購自香精色素科技（中國）有限公司；制霉菌素口用凝膠和空白樣品均有企業提供。

1.5 方法

根據《抗生素微生物檢定法及其標準操作》[17]、《衛生部頒標準WS1-C2-0025-89》和《國家藥品監督管理局進口標準JX20050133》，本文制霉菌素的測定方法采用二劑量法、單層培養基測定法，選擇N，N-二甲基甲酰胺（DMF）作為溶劑[18]，考察試驗菌株、溶劑濃度、菌層體積、緩沖溶液、培養溫度、培養時間和培養基適用性等7個影響抑菌圈測量的因素。

2 結果與討論

2.1 抑菌圈影響因素考察

2.1.1 試驗菌

《抗生素微生物檢定法及其標準操作》[17]規定，試驗菌選擇要以測定濃度下抗生素主成分產生明顯清晰的抑菌圈，且所含雜質、降解物等不產生可見抑菌圈為前提條件。

本文選擇啤酒酵母ATCC9763和啤酒酵母ATCC2601作為試驗菌，比較制霉菌素對兩株試驗菌產生的抑菌圈。結果表明，相較于啤酒酵母ATCC9763，啤酒酵母ATCC2601的抑菌圈邊緣更整齊、清晰和穩定，圈內更透明，且不產生次級圈，見圖1。因此，選擇啤酒酵母ATCC2601作為制霉菌素效價測定的試驗用菌。

2.1.2 溶劑濃度

精密稱取制霉菌素標準品，用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）稀釋制成約含1000 U/mL的溶液，精密量取5 mL轉移至100 mL容量瓶，用磷酸鹽緩沖液（pH6.0）[磷酸氫二鉀：磷酸二氫鉀（20：80， V/V）] 定容，制成約含制霉菌素50 U/mL的標準品溶液。不含制霉菌素的DMF的3%（V/V）、5%（V/V）和7%（V/V）溶液，作為測試溶液。磷酸鹽緩沖液（pH6.0）作空白對照溶液。

結果表明，標準品溶液有抑菌圈，而含3%（V/V）、5%（V/V）和7%（V/V）DMF的測試溶液均未生成抑菌圈，5%±2%（V/V）DMF溶液對制霉菌素微生物測定的影響可以忽略，見圖2。

2.1.3 菌層培養基體積

分別制備加入15、20和25 mL含菌培養基的平板，進行制霉菌素的微生物檢定。結果表明，相較于15和25 mL，20 mL菌層菌苔厚度適中，抑菌圈邊緣整齊，滿足試驗需求，見圖3。

2.1.4 培養溫度和時間

設定培養溫度為28℃、30℃和32℃，培養時間為18、20、24、36和48 h，進行制霉菌素的效價測定。結果表明，培養溫度為28℃，牛津杯里有藥液殘留，且抑菌圈邊緣不清晰，影響儀器進行測量計算。而培養時間為18 h，抑菌圈偏離平行及可行限率偏高，而培養時間超過24 h，培養基易失水開裂，影響抑菌圈觀察和測量。因此，確定培養溫度為30～32℃，培養時間為20～24 h。

2.1.5 緩沖溶液

《中國藥典》2020年版四部1201抗生素微生物檢定法[12]收載磷酸鹽緩沖液（pH6.0）為磷酸氫二鉀

2 g：磷酸二氫鉀8 g，而《國家藥品監督管理局進口標準JX20050133》收載磷酸鹽緩沖液（pH6.0）為磷酸氫二鉀20 g：磷酸二氫鉀80 g。本課題考察以上兩種磷酸鹽緩沖液（pH6.0）在制霉菌素微生物測定中對啤酒酵母生長的影響，結果表明，磷酸鹽緩沖液（pH6.0，磷酸氫二鉀20 g ：磷酸二氫鉀80 g）用于試驗，所得到的抑菌圈邊緣更加整齊，見圖4。

2.1.6 培養基

選擇A、B、C 3個廠家的制霉菌素檢定成品培養基，同時按處方自行配制培養基，開展培養基考察。精密稱取制霉菌素標準品和待測樣品適量，考察4種來源培養基制霉菌素測定結果的RSD值，同時以抑菌圈邊緣整齊、透明和次生圈作為考察指標。結果表明，3個廠家的商品培養基和自制培養基測定樣品制霉菌素效價結果的RSD為0.8%，小于1%，且平板上的抑菌圈均清晰透明、邊緣整齊、不產生次級圈，說明不同來源的培養基均適用于該制霉菌素的測定方法，該制霉菌素的微生物測定方法在不同來源培養基上無差異。

2.1.7 方法建立

根據7個因素的單因子考察試驗，建立制霉菌素的效價測定方法。精密稱取供試品適量（約相當于制霉菌素100000單位），加入適量DMF，超聲使分散溶解，再用DMF稀釋制成每1 mL中約含1000單位的溶液，搖勻；精密量取此溶液適量，加入DMF適量，使測定溶液中DMF的濃度為5%（V/V），再加入磷酸鹽緩沖液（pH6.0，磷酸氫二鉀20 g：磷酸二氫鉀80 g）定量稀釋制成約含制霉菌素40和20 U/mL的溶液，以啤酒酵母ATCC2601為試驗菌，采用單層培養基測定，置30～32℃，培養20～24 h。

2.2 方法驗證

2.2.1 專屬性

以制霉菌素口用凝膠作為制劑研究對象，取制劑處方中輔料按比例混合后，進行方法專屬性分析，羥乙基纖維素、蔗糖、甘油、羥苯甲酯、羥苯丙酯、草莓香精和空白樣品（輔料按比例混合）均未見抑菌圈，試驗結果證實所用輔料對制霉菌素的測定方法無明顯干擾。

2.2.2 準確度

取制霉菌素原料（6500 U/mg）和輔料，按照標示量（250萬U/支）的80%、100%和120%制備混勻，作為待測樣品。精密稱取一定量的待測樣品置量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度使成1000 U/mL溶液，作為樣品溶液。精密稱取制霉菌素標準品置量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度使成1000 U/mL溶液，作為標準品溶液。分別量取供試品溶液與標準品溶液適量，加入適量DMF，使終濃度為5%，用pH6.0磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中約含制霉菌素40與20 U的溶液。

3組濃度供試品溶液的回收率均大于95%，RSD為0.44%，證明該方法的準確性良好，結果見表1。

2.2.3 中間精密度

精密稱取制霉菌素標準品16.83 mg，置100 mL容量瓶中（含制霉菌素992.97 U/mL），加DMF溶解并稀釋至刻度，精密量取適量加入適量DMF，使其終濃度為5%，用磷酸鹽緩沖液（pH6.0）稀釋至刻度，搖勻，制成約含制霉菌素40與20 U/mL的溶液，平行制備6組。分別采用兩臺儀器測定，進行該方法的儀器比對，試驗結果計算均值和RSD。同時由兩位實驗人員分別開展試驗，進行人員比對，試驗結果計算均值和RSD。

實驗結果顯示：不同儀器和不同實驗人員測定結果均接近真值（100%），儀器比對和人員比對的RSD均小于1%，證明該方法中間精密度準確可靠，結果見表2。

2.2.4 線性測定

根據《抗生素微生物檢定法及其標準操作》，采用以下試驗用于確定制霉菌素測定方法線性關系的范圍。精密稱取制霉菌素標準品25.40 mg，置100 mL量瓶中，加DMF溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準品溶液（1498.6 U/mL），精密量取適量，加入適量DMF，使其終濃度為5%，用磷酸鹽緩沖液（pH6.0）定量稀釋制成91.71、73.13、58.15、46.76、37.46、29.97、23.98、19.18、15.29和12.29 U/mL共10組濃度的溶液，劑間濃度比為1： 0.80；以19.18 U/mL濃度點作為中心點濃度，測得抑菌圈（y0）在15.7～17.4 mm，最高濃度點91.71 U/mL測得抑菌圈（yk）在19.5～20.9 mm。

在雙碟菌層培養基表面，放置6枚鋼管，在相間隔的3個鋼管內，滴加中心點濃度C0，在其他3個鋼管內滴加線性濃度樣品C1～C10，每個濃度點，配制5個雙碟；共測定10個濃度。以制霉菌素溶液濃度的對數值（logC）與各濃度點抑菌圈直徑差值均值（fk）作線性分析，得回歸方程與相關系數r，見圖5。制霉菌素溶液濃度范圍在91.71～12.29 U/mL，線性方程為y=6.2058-9.4435x，r=0.9937，在0.05水平上顯著。

3 討論

管碟法測定抗生素的效價，不僅受到抗生素量多少和抗生素最低抑菌濃度的影響，而且也與瓊脂層厚度、抗生素在瓊脂培養基內的擴散系數、擴散時間等因素有關。相較于其他抗生素，制霉菌素溶液不易擴散，在瓊脂培養基內的擴散系數小，因此直接在雙碟內加單層菌層，以利抑菌圈的形成，可獲得更好的線性關系，而不宜使用底層培養基加菌層培養基的雙層培養基方法制備雙碟用于制霉菌素的微生物檢定。

本文建立了單層菌層的二劑量管碟法測定制霉菌素口用凝膠中制霉菌素含量的方法，該方法制霉菌素抑菌圈直徑差值均值與制霉菌素濃度（91.71～12.29 U/mL）的對數值呈現良好的線性關系，準確度、專屬性和精密度均能滿足要求，適合制霉菌素的含量測定。

參 考 文 獻

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