持留菌的臨床相關性及防治研究進展

摘要：持留菌（persisters）指的是細菌群體中的一個小亞群，它們可以在致死濃度的抗生素應激下進入休眠狀態，躲避抗生素的殺傷，然而這種耐受抗生素的能力并不具備可遺傳性，在抗生素壓力降低或者去除時持留菌便可正常生長并恢復對抗生素殺菌的敏感性。本文介紹了持留菌的生物學特性及其與慢性感染等臨床相關問題的關系，綜述了TA模塊及SOS反應等促進細菌持留形成的分子機制，總結了現有研究中針對細菌持留可行的防治手段，以期引發臨床對持留菌更廣泛的關注和警惕，且為持留菌的深入研究與防治提供參考。

關鍵詞：抗生素；持留菌；慢性感染；生物膜；防治策略

中圖分類號：R9 文獻標志碼：A

Advances in clinical relevance and treatment strategies of bacterial persisters

Feng Jia-ni， Li Wei-wei， Zhu Wei-wei， Xue Yun-xin， Wang Dai， and Zhao Xi-lin

（State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics， School of Public Health， Xiamen University，

Xiamen 361102）

Abstract Persisters refer to a small subgroup of bacterial populations that can enter a dormant state under lethal concentrations of antibiotic stress and evade the killing by antibiotics. However， the ability of persisters to tolerate antibiotic killing is not heritable. Persister bacterial cells can resume normal growth when the antibiotic pressure dissipates and regain sensitivity to antibiotic-mediated killing. In this paper， the biological characteristics of persistent bacteria and their relationship with related clinical issues， such as chronic infection， are introduced. The molecular mechanisms of toxin-antitoxin （TA） modules and SOS responses that promote the formation of bacterial persistence are reviewed. Currently available preventive strategies that are feasible for controlling bacterial persistence are also summarized in order to draw broad attention to and remain vigilance on clinical implications of persistent bacteria. Such work is expected to provide guidance for in-depth research and preventive measures of persistent bacteria.

Key words Antibiotics; Bacterial persisters; Chronic infections; Biofilms; Treatment strategies

抗生素的發現是人類歷史上的一個高光時刻，它挽救了無數人的生命。然而，細菌也進化出不同機制如耐藥、耐受及持留來應對抗生素壓力，最終導致臨床上抗感染治療失敗。抗生素耐藥性（antibiotic resistance）指的是攜帶可遺傳耐藥機制（如降低藥物與其靶標結合的突變、外排泵表達的增加、編碼抗生素滅活酶）的細菌能在高濃度抗生素下生長的能力，且其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）明顯升高[1-2]。除抗生素耐藥性外，還存在其他機制可以幫助細菌在抗生素殺傷下存活，如抗生素耐受性（antibiotic tolerance）：細菌能夠暫時承受或減緩高濃度抗生素的殺傷，但是不能增殖，其MIC不發生改變的特性[3]。與抗生素耐藥/耐受性不同，抗生素持留性（antibiotic persistence）指的是細菌亞群在高濃度抗生素下存活的能力[4]。持留菌的存在常常是臨床上抗生素治療失敗的原因：臨床大多數抗生素的殺滅效率主要依賴于細菌的生理狀態，而持留菌在致死濃度抗生素的存在下不能增殖但也不會被殺死，而是轉換為休眠狀態。這種生長停滯的休眠狀態導致持留菌對抗生素不敏感，因此難以被大多數抗生素徹底清除[5]。當抗生素壓力下降或去除時，持留菌又可以恢復生長，并完全恢復對抗生素殺菌的敏感性。越來越多的臨床案例如囊性纖維病[6]、結核病[7]和尿路感染[8]等都證明了持留菌與臨床上抗生素治療失敗的關系，因此對持留菌形成的探究及防治手段的開發也愈發重要。本文綜述了持留菌的特點及臨床相關性、形成的機制及治療手段，有利于加強人們對持留菌的認識，幫助預防、控制持留菌。

1 持留菌的生物學特性

1942年，Hobby等[9]發現青霉素可以殺死99%的鏈球菌培養物，然而還有1%的細菌存活。兩年后，Bigger[10]在研究青霉素的作用機理時發現及證實了這種現象，并將這1%的細菌命名為持留菌。然而在隨后幾十年持留菌并沒有引起人們的關注，直到有研究發現生物膜中存在著持留菌[11]，而病原體的生物膜形成是臨床上各種慢性疾病治療失敗的重要原因，至此持留菌才廣泛引起了科學家的關注。

持留菌具有普遍性、休眠、多藥耐受、不可遺傳、可逆性等多個生物學特性。革蘭陰性菌和革蘭陽性菌都能夠形成持留菌[12]。盡管Bigger只在青霉素處理的情況下觀察到持留菌的存在，但是暴露在其他作用機制抗生素（如喹諾酮類抗生素）中的細菌培養物也會形成持留菌[13]。有研究通過微流體裝置和單細胞分析，成功證明了青霉素處理下形成的持留菌處于休眠狀態[14]。休眠是持留菌應對抗生素壓力下的主要方式，而抗生素主要通過抑制重要的細菌過程如復制、轉錄和翻譯來發揮作用。由于持留菌生長停滯，對抗生素不敏感，所以持留菌常表現出多藥耐受性。然而，這種耐受性并不能遺傳，當抗生素的壓力撤去后持留菌便在正常環境下復蘇，并恢復對抗生素的敏感性[5，15]。生長恢復后的細菌失去了持留菌的特征，表現出與抗生素敏感菌株相同的表型，這也表明持留菌可在持留與非持留之間可逆地改變其生理狀態[16]。

2 持留菌的臨床相關性

2.1 持留菌與慢性感染

在沒有抗生素治療的情況下，宿主免疫系統無法徹底清除病原菌時會引起自身的慢性感染。例如：萊姆病（lyme disease， LD）是一種常見的蜱傳疾病，由細菌伯氏疏螺旋體引起。伯氏疏螺旋體擁有復雜的抗原變異系統，表面結合脂蛋白VlsE序列能導致病原體表面抗原的改變，從而阻礙宿主免疫系統的識別[17]。當宿主組裝并產生抗體來清除變異病原體時，又有新的變異病原體涌現。這種不斷的變異永遠比宿主免疫反應領先一步，導致宿主免疫無法徹底清除病原菌，導致慢性感染。但即便進行了抗生素的規范治療，仍有10%～15%的萊姆病患者會出現萊姆病綜合征（post-treatment Lyme disease syndrome， PTLDS），患者出現疲憊、疼痛和認知困難等癥狀，嚴重影響患者的生活質量[18]。隨著研究的逐漸深入，研究者發現這種現象可能跟持留菌的存在相關[19]。

銅綠假單胞菌是囊性纖維病（cystic fibrosis， CF）患者呼吸道感染中最常見的機會致病菌，該病原體能夠通過多種方式包括分泌外毒素、形成生物膜、逃避宿主免疫系統及獲得多種抗生素耐藥性來適應環境，且其鞭毛系統能幫助其在不同生態位中定植，從而在患者體內持續多年存在并引起慢性感染，最終導致患者肺部功能下降甚至死亡[20]。然而研究發現，臨床分離出來銅綠假單胞菌并不總有耐藥性[21]，因此有研究者懷疑CF患者慢性感染可能是持留菌存在的結果。Mulcahy等通過分析14名CF患者早期感染和晚期感染的分離株，發現與早期分離株相比，14株晚期分離株有10株顯示出hip高持留表型[6]。這是首次直接證明了持留菌與慢性感染的關系。此后，陸續有研究從念珠菌病、尿路感染、結核分枝桿菌感染等臨床相關疾病的慢性感染患者身上分離出持留菌[22-24]，這些發現證明了持留菌在慢性感染中的關鍵作用。

2.2 持留菌與生物膜感染

革蘭陽性菌和革蘭陰性菌病原體都可以產生生物膜，且生物膜一旦形成，細菌就能在生物膜里躲避各種抗生素的殺傷。這也導致臨床抗感染治療困難及各種感染復發，如植入裝置感染、尿路感染、結核病等疾病的出現[25]。早期研究在測試銅綠假單胞菌生物膜對氧氟沙星的劑量反應時就發現，即便抗生素濃度非常高，也無法根除一小部分細菌[26]。近年來有研究者發現使用環丙沙星處理銅綠假單胞菌生物膜模型1 h后，細菌會調動嚴謹反應相關基因spoT、relA、編碼蛋白酶Lon的基因和毒素-抗毒素基因的過表達，誘導一部分細菌向持留表型轉變。且盡管經過24 h的抗生素治療，環丙沙星破壞了生物膜基質，也殺死了大多數敏感細菌，但少量持留細菌仍然沒有被根除，一旦抗生素水平下降，持留菌便會重新填充生物膜，最終導致抗感染治療失敗[27]。在真菌中也發現類似的現象，用兩性霉素B處理白色念珠菌形成的生物膜發現膜中真菌大部分群體被殺死，而一小部分群體仍然存在，且不受高濃度抗菌藥物的影響[28]。除實驗室菌株外，Kaviar等[29]通過以91株臨床分離糞腸桿菌形成的生物膜為研究對象，分析發現其中3株分離株為持留菌，與非持留菌分離株相比，持留菌分離株顯示出更高水平的生物膜相關基因表達和生物膜形成能力，并且由持留菌形成的生物膜對萬古霉素具有更強的耐受性。這些結果說明生物膜結構中存在持留菌是治療失敗和感染復發的主要因素之一。

2.3 持留菌與耐藥性

除了與持續性感染相關聯，細菌持留已被證明能為細菌耐藥性的發展鋪平道路。有研究證明細菌持留性跟耐藥性的進化在天然分離株或實驗室的大腸埃希菌菌株中都呈正相關，持留菌可以通過提高生存率和突變率來促進耐藥性的發展[30]。

總而言之，持留菌在導致臨床上各種慢性疾病及細菌耐藥的發展中有關鍵作用，因此對持留菌的深入探究可為持續性感染及耐藥菌感染治療提供理論基礎。此外，在模擬藥物敏感型人類腫瘤細胞系對各種抗癌藥物的反應時，研究始終能監測到一小部分可逆的“耐藥”細胞，這些細胞亞群能短暫地呈現出可逆的藥物耐受狀態，以保護群體免受致命壓力的根除[31]。基于持留菌與腫瘤的耐受亞群存在相似之處，對持留菌的探究也可能為耐藥腫瘤細胞的臨床研究提供參考。

3 持留菌形成機制

基于細菌持留對臨床抗感染治療的不利影響，了解持留菌產生的機制就十分必要。持留菌的形成十分復雜且尚未完全研究清楚，各種因素都可能引起細菌的應激從而介導持留的形成。下面將從TA模塊、SOS反應、（p）ppGpp等來綜述持留菌的形成機制。

3.1 TA模塊

隨著對細菌持留現象研究的逐漸深入，毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）模塊被證明是影響細菌持留形成的重要因素。目前已報道的TA模塊可分為6類，且廣泛地存在于細菌中，它由兩個基因組成：一個編碼干擾細胞基本過程的蛋白質（毒素），另一個編碼抑制毒素活性的RNA或蛋白質（抗毒素）[32-33]。在正常情況下，毒素與抗毒素結合導致毒素失活，細菌的復制和代謝正常進行。然而在壓力條件下，TA模塊中毒素的積累或毒素與抗毒素的不平衡會導致細菌的生長停滯和持留形成[33]。多種TA系統如hipBA[34]、MazEF[35]、mqsRA[36]和tisAB/istR[37]等被報道與病原菌持留的形成有關。上文提到在喹諾酮類藥物處理銅綠假單胞菌生物膜模型時會促進細菌重組修復跟毒素-抗毒素基因的過表達，誘導一部分細菌向持留轉型[27]。

3.2 SOS反應

SOS反應被證明與持留菌的形成相關。氧化應激、抗生素、紫外線等壓力下會引起細菌DNA損傷，產生單鏈DNA，激活RecA蛋白，促進LexA阻遏蛋白的自裂解，導致SOS相關調控基因的去阻遏，各種參與同源重組和修復的蛋白基因表達來修復DNA損傷，細菌死亡率降低，持留菌生成[38-39]。氟喹諾酮類藥物能夠作用于細菌的解旋酶和拓撲異構酶來誘導雙鏈DNA斷裂導致細菌死亡[40]。其中RecA和RecB蛋白對于修復大腸埃希菌中的雙鏈DNA斷裂修復至關重要。在大腸埃希菌中，與野生型菌株相比，ΔrecA和ΔrecB在環丙沙星處理6h后持留菌數量大大降低，ΔrecA減少了40倍，ΔrecB最高減少了103倍[41]。此外，SOS反應能夠參與TA模塊介導的細菌持留，在DNA損傷和SOS反應誘導下，tisAB/istR模塊中TisB蛋白過量表達，通過降低質子動力和ATP水平，介導細菌代謝降低，進入休眠狀態，形成持留菌[37]。

3.3 胞內信號（p）ppGpp

（p）ppGpp是一種胞內信號，其能夠直接抑制RNA聚合酶、參與翻譯過程的幾種酶以及GTP生物合成，導致細菌翻譯抑制和生長停滯，對細菌在多種抗生素殺傷、營養匱乏等應激下的生存至關重要[42-43]。過去的許多研究發現，（p）ppGpp的存在與細菌持留現象相關。例如在營養缺乏的環境下GTP酶Obg介導的細菌持留依賴于 （p）ppGpp，其中（p）ppGpp激活I型TA模塊hokB-sokB的轉錄表達，導致HokB毒素水平的升高，膜去極化，介導細菌進入休眠狀態[44]。Liu等[45]通過對15個常見的持留相關基因敲除株與（p）ppGpp的關系進行系統研究，發現ΔdnaK和ΔrecA在慶大霉素和氨芐西林作用下依賴于（p）ppGpp影響持留菌的形成，而其他基因與（p）ppGpp在細菌持留形成過程中表現出協同、拮抗等不同的關系。

3.4 其他機制

除上述機制外，還有許多因素被證明能夠促進持留菌的產生，如持留菌可以由細菌分泌到細胞外的代謝物刺激形成。吲哚作為細菌間的信號分子控制著細菌的生理過程，如生物膜形成、耐藥性、毒力等[46]。氧氟沙星的刺激下會導致無法合成海藻糖的大腸埃希菌ΔotsA突變體內氧化應激和吲哚的過度產生[47]，從而導致細菌對抗生素的耐受和持留菌的生成。此外，一種群體感應（quorum sensing， QS）分子群體感應肽信息素可以向變形鏈球菌細菌群體發出壓力信號，使其產生適當的應激反應，促進持留菌的形成[48]。

多種外界環境因素被報道與促進持留菌的形成相關，如營養匱乏：氮饑餓的條件下大腸埃希菌的（p）ppGpp合成增加，對環丙沙星耐受的持留菌數量增多[49]。除了營養變化，pH、滲透壓、氧化應激和抗生素壓力等都是觸發持留形成的關鍵因素。滲透壓對于細菌維持正常的細胞形態、正常生長和分裂具有重要作用。與無滲透壓對照組相比，許多化學物質的添加（如亞硝酸鈉、尿素等）會影響大腸埃希菌培養物中的持留菌數量。此外還發現與無緩沖液的對照組相比，當細菌處于高酸性環境（pH≤5）時，其持留菌的形成顯著降低[50]。用過氧化氫處理大腸埃希菌培養物或通過向培養基中添加水楊酸鹽產生活性氧（reactive oxygen species， ROS）也會導致持留菌增加[51]。

4 持留菌的防治

由于持留菌處于休眠狀態，對抗生素的殺傷不敏感，因此近年來針對持留菌的防治策略主要從直接破壞細菌結構、促進持留菌復蘇來恢復對藥物敏感性、藥物聯合、干擾持留的形成等這幾方面入手。

4.1 直接殺死休眠的持留菌

抗生素的殺菌能力強烈依賴于細菌的代謝狀態，而持留菌能夠暫時終止或者延遲各種細胞代謝活動，對致死濃度的抗生素具有耐受性，因此需要采取其他的策略來代替傳統抗生素進行殺菌。盡管持留菌處于休眠狀態，細菌仍需要如細胞壁和細胞膜等結構屏障來維持細菌的生存，因此可以通過直接破壞細菌結構屏障的功能來殺死持留菌。抗持留分子1-（（2，4-二氯苯乙基）氨基）-3-苯氧基丙烷-2-醇（SPI009）能夠迅速損傷細菌的內外膜，殺死處于持留狀態的革蘭陰性和革蘭陽性病原體[52]。同理，超短肽類藥物能夠引起分枝桿菌的膜損傷，顯著降低小鼠肺部的細菌載量[53]。硼霉素能夠使膜電位去極化、細胞內ATP水平降低和蛋白質泄露，殺死持留的結核分枝桿菌，對其他的革蘭陽性菌如金黃色葡萄球菌、表皮鏈球菌和糞腸桿菌也表現出較好的生長抑制和殺菌活性[54]。電化學處理后細胞內ROS產量增加，介導銅綠假單胞菌細胞膜通透性改變，從而增強妥布霉素對持留菌的根除[55]。此外，FDA批準的抗癌藥物順鉑（順式-二氨二氯合鉑）能形成DNA交聯，通過與生長無關的機制根除大腸埃希菌K-12的持留菌[56]。

4.2 促進持留菌的代謝或增加抗生素內流

由于大多數抗生素通過破壞細菌的DNA、蛋白質等生物大分子的合成來進行殺菌，因此刺激持留菌的代謝可以增強抗生素的活性。研究表明脂肪酸信號分子順式-2-癸烯酸能夠刺激銅綠假單胞菌和大腸埃希菌持留菌的代謝，使細菌從休眠狀態進入代謝狀態，從而恢復持留菌對抗生素的敏感性[57]。除了添加外源物質刺激持留菌的代謝，脈沖式給藥也可促進持留菌從休眠狀態到活性狀態的過渡：在使用阿莫西林或頭孢曲松處理伯氏疏螺旋體培養物處理后，去除殘留的抗生素，存活的持留菌在新鮮培養基中復蘇，再讓其暴露在抗生素中再進行同樣的步驟。經過反復處理4輪后，阿莫西林處理后的培養物持留菌明顯減少，而頭孢曲松處理的培養物中細菌被完全根除[19]。這種脈沖式給藥實驗表明該方法可用于常規抗生素治療疾病來達到清除病原體的目的。

改變細胞膜的通透性或者破壞細胞膜能使抗生素更易流入細胞，從而提高抗生素濃度來進行殺菌。快速冷凍會導致持留菌的細胞膜不穩定，激活機械敏感離子通道McsL，從而增加細菌對氨基糖苷類抗生素的攝取，增強了抗生素的殺菌效果[58]。卡那霉素與富含脯氨酸的P14LRR抗菌肽的偶聯物P14KanS通過選擇性地破壞細菌的細胞膜及生物膜，增加抗生素內流，提高抗生素的殺傷效率[59]。

4.3 藥物聯合治療

持留菌形成機制的復雜性也對單一靶點的抗生素帶來了巨大挑戰。藥物聯合療法能夠利用已知藥物，降低開發的新藥成本，且有利于藥物不同靶點之間的協同作用，從而達到根除持留菌的目的。盡管持留菌處于休眠狀態，細胞膜的完整性對其維持正常的生理也極為重要。抗菌肽能夠靶向細菌的細胞膜來破壞膜結構的穩定性，從而使藥物能夠輕松穿過持留菌的膜屏障。例如黏菌素與阿米卡星的聯合使用可以通過改變持留菌的細胞膜電位及形態來治療鮑曼不動桿菌感染[60]。持留菌可以產生生物膜來保護細菌免受抗生素的殺傷，而黏菌素與紅霉素的組合可以清除銅綠假單胞菌形成的生物膜，提高抗生素的治療效果[61]。此外，其他具有生物活性或者低細胞毒性的化合物也可以作為佐劑與抗生素聯合使用，提高抗生素的殺菌效率[62]。半胱氨酸的加入增強了異煙肼對結核分枝桿菌的殺傷作用，可能是半胱氨酸在氧化成胱氨酸的過程中產生大量的ROS造成的[63]。合成的類視黃醇CD437和CD1530能夠破壞細胞膜的脂質雙分子層，與慶大霉素具有協同作用，能夠殺滅持留的金黃色葡萄球菌[64]。

4.4 干擾與細菌持留形成的相關因子

隨著對持留菌形成機制研究的逐漸深入，人們發現可以通過干擾持留形成的過程，來減少持留菌生成的數量。毒素-抗毒素系統常常被認為與持留菌的形成相關，前期的研究發現，3種中鏈不飽和脂肪酸乙酯：反式-2-癸烯酸乙酯、反式-2-辛烯酸乙酯和順式-4-癸烯酸乙酯在與環丙沙星或者氨芐西林抗生素聯合使用時都能夠通過調節抗毒素蛋白HipB來降低持留菌的生成[65]。葉酸能參與到許多生物代謝途徑如氨基酸、蛋白質、嘌呤和嘧啶等的合成，對細菌維持正常的生理功能極為重要[66]。葉酸拮抗劑的添加擾亂了細菌正常的葉酸代謝，降低了在氨芐西林或氧氟沙星抗生素下形成的持留菌數量[67]。嚴謹反應對細菌激活生存策略如進入靜止期、生成孢子或者生物膜的形成都至關重要，而（p）ppGpp的積累能誘導細菌發生嚴謹反應。化合物Relacin能夠抑制RelA的合成酶活性，影響革蘭陽性菌進入靜止期并導致細菌死亡[68]。細菌能通過群體感應過程中的信號分子來調節毒力基因的表達及生物膜的形成，其中2-氨基苯乙酮（2-aminoacetophenone， 2-AA）由QS調節因子MvfR通過pqsABCDE操縱子的轉錄調控進行控制合成。2-AA通過能響應群體信號的傳導，調節細胞翻譯相關基因的表達來介導細菌持留。MvfR拮抗劑M64能夠降低2-AA的合成，降低銅綠假單胞菌形成持留菌的能力。當M64與環丙沙星聯合使用時能夠徹底清除小鼠體內的感染，且防止細菌的重新定植[69-70]。

5 展望

本文主要闡述了持留菌與臨床疾病之間的聯系、其形成機制及對持留菌的防治手段（圖1）。雖然近年來對持留菌的研究已經有了不少突破，但目前仍有較多領域有待進一步推進。例如，如何快速確認哪種機制介導了臨床菌株的持留形成，這有助于防治策略的制定；環境中的微生物種類往往并不單一，微生物組與某類細菌的持留是否存在聯系；細菌自身的代謝停滯導致持留的產生，反之宿主代謝微環境是否會影響細菌持留的產生或防治；細菌持留會增加抗生素耐藥性，而特定針對持留菌的療法是否有助于抵擋抗生素耐藥危機？對于這些問題的深入探究，有助于推動抗持留菌藥物及其他防治策略的開發，對未來根除持留菌，成功治療慢性感染有重大意義。

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