響應(yīng)面法優(yōu)化硅藻土對(duì)解淀粉芽孢桿菌fmbJ的吸附及其表征

摘要：采用硅藻土（DE）作為固定載體，吸附解淀粉芽孢桿菌fmbJ制備微生物殺菌劑。通過單因素、Plackett-Burman和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化吸附條件，采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、激光粒度儀和掃描電子顯微鏡-能量色散光譜儀（SEM-EDS）對(duì)微生物殺菌劑進(jìn)行表征，并對(duì)其抑菌活性和貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行探究。結(jié)果表明，最優(yōu)吸附條件為：29 ℃，80 r/min水浴條件下，每5 mL菌液添加0.10 g DE吸附58 min，該條件下的吸附率為（89.23±3.08）%，菌數(shù)5.80×1010 CFU/g；DE通過物理作用將fmbJ吸附于孔洞內(nèi)部；該殺菌劑對(duì)黑曲霉、黃曲霉、灰綠曲霉具有顯著的拮抗作用且具有良好的貯藏穩(wěn)定性，-20 ℃條件下貯藏180 d后fmbJ的存活率約為80%（4.64×1010 CFU/g）。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；硅藻土；Box-Behnken；固定化；SEM-EDS

中圖分類號(hào)：S182；S435 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20230221

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（BK20200835）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）。

Optimization of diatomaceous earth adsorption of Bacillus amyloliquefaciens fmbJ by response surface methodology and its characterization

Zhang Jin， Luo Xiaojiao， Sun Jing， Lu Yingjian

（College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing， Jiangsu 210023 ）

Abstract： Diatomaceous earth （DE） was used as an immobilization carrier for the preparation of microbial fungicides by adsorption of Bacillus amyloliquefaciens fmbJ. The adsorption conditions were optimized by single-factor， Plackett-Burman and Box-Behnken experiments. The microbial fungicides were characterized by fourier transform infrared spectroscopy （FTIR）， laser particle size measurement， and scanning electron microscopy-energy dispersive spectroscopy （SEM-EDS）.The antibacterial activity and storage stability were also investigated. The results showed that the optimal adsorption conditions were as follows： Per 5 mL of bacterial solution with 0.10 g DE was adsorbed for 58 min at 29 ℃ with 80 r/min water bath. The adsorption rate under these conditions was （89.23±3.08）%， with bacteria count of 5.80×1010 CFU/g. DE adsorbed fmbJ inside the pores by physical action. The fungicide had a significant antagonistic effect on Aspergillus niger， Aspergillu oryzae， and Aspergillus glaucus. It had good storage stability， and the survival rate of fmbJ was about 80% （4.64×1010 CFU/g） after 180 d storage at -20 ℃.

Key words： Bacillus amyloliquefaciens， diatomaceous earth， Box-Behnken， immobilization， SEM-EDS

2020年11月—2021年10月，市場監(jiān)督總局發(fā)布不合格食品382批次，其中微生物污染占不合格食品28%，是不合格產(chǎn)品的主要原因之一[1]。微生物污染主要分為細(xì)菌、真菌和病毒污染，其中真菌會(huì)造成果蔬、谷物等日常食品腐敗并產(chǎn)生真菌毒素，從而引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失和安全健康問題[2-5]。目前市面上存在的殺菌或抑菌產(chǎn)品主要為化學(xué)殺菌劑。由于化學(xué)殺菌劑會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染、食品殘留等安全問題，已經(jīng)不符合中國新時(shí)代綠色發(fā)展的主題[6]。微生物源殺菌劑因其安全性高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為現(xiàn)代殺菌劑開發(fā)的主流[7]。

解淀粉芽孢桿菌fmbJ（Bacillus amyloliquefaciens fmbJ）是革蘭氏陽性菌，屬于芽孢桿菌屬，其作為一種生防菌，可以形成抵御惡劣環(huán)境的芽孢，還可以產(chǎn)生一系列的具有抗菌作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物，如抗菌脂肽[8-10]等，在糧食貯藏、果蔬保鮮等方面有廣闊的應(yīng)用前景[2，5，11]。但其存在獲取活性芽孢少、步驟繁瑣、耗時(shí)長、生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)而無法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)以及不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求[12]。采用固定化技術(shù)對(duì)解淀粉芽孢桿菌fmbJ進(jìn)行優(yōu)化，可以提高fmbJ的穩(wěn)定性，增強(qiáng)其抵抗惡劣環(huán)境的能力等[13]。

吸附法是微生物固定的方法之一，其工業(yè)流程簡單、成本低、操作簡易、載體綠色環(huán)保、對(duì)微生物活性損傷小等特點(diǎn)而常作為微生物殺菌劑固定的方法之一[14]。載體的選擇采用無機(jī)材料硅藻土（DE）。DE具有原料易得、綠色環(huán)保、成本低廉、水潤性好、比表面積大、吸附性能好等優(yōu)點(diǎn)[15-18]，在微生物固定方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[19]。但鮮有探究硅藻土對(duì)解淀粉芽孢桿菌的吸附條件及相關(guān)吸附機(jī)制的報(bào)道。

本研究采用解淀粉芽孢桿菌fmbJ為實(shí)驗(yàn)菌株，DE為吸附載體，采用響應(yīng)面法優(yōu)化吸附條件，并對(duì)其吸附機(jī)制、抑菌活性、貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行探究，旨在為解淀粉芽孢桿菌菌劑的研制、優(yōu)化及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和儀器

Celite610硅藻土：杭州崇科新材料有限公司；PDA培養(yǎng)基：青島日水有限公司；丙酸鈣：上海麥克林生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物：英國Oxoid公司；NaCl：南京試劑股份有限公司。

SHA-B型恒溫水浴震蕩器：寧波東南儀器有限公司；Spectrum Two型傅里葉紅外光譜：美國PerkinElmer公司；Zeiss Gemini 300型環(huán)境掃描電子顯微鏡：德國Zeiss公司；BL800R型離心機(jī)：上海盧湘儀儀器有限公司；EYELA SLI-400型恒溫培養(yǎng)箱：日本EYELA東京理化公司；Microtrac S3500型激光粒度儀：美國Microtrac公司；牛津Xplore能譜儀：英國Xplore公司；MQD-S3R型三層搖床：上海旻泉儀器有限公司。

1.1.2 菌株

解淀粉芽孢桿菌fmbJ（CGMCC 0943）：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室；黑曲霉（A. niger， MK779059.1）、黃曲霉（A. oryzae，MTO93257.1）、灰綠曲霉（A. glaucus，M206022）：南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品營養(yǎng)與功能因子實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L、蒸餾水定容、pH 7.0～7.2；配制固體培養(yǎng)基時(shí)，每100 mL培養(yǎng)基加入1.5 g瓊脂粉。121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：稱取39 g樣品，溶于1 L超純水，加熱溶解，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 微生物的培養(yǎng)

挑取一環(huán)fmbJ單菌落接種于LB培養(yǎng)基（25 mL 100 mL三角瓶），37 ℃、180 r/min的條件培養(yǎng)15 h。取1% fmbJ菌液再次接種于LB培養(yǎng)基37 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)36 h后備用。

挑取黑曲霉、米曲霉、灰綠曲霉孢子接種于PDA培養(yǎng)基，于28 ℃條件下培養(yǎng)72 h后備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)

單因素的基準(zhǔn)條件為：每5 mL fmbJ菌液中添加0.1 g DE，30 ℃的條件下水浴振蕩吸附60 min。吸附完成后，過濾，除去上清液，沉淀于45 ℃的烘箱中干燥12 h。采用稀釋涂布法對(duì)吸附前菌液中的fmbJ和DE吸附的fmbJ進(jìn)行計(jì)數(shù)，并按式（1）計(jì)算吸附率。

單因素實(shí)驗(yàn)一共設(shè)置4個(gè)單因素：DE添加量（0.05、0.10、0.20、0.40 g）、吸附時(shí)間（10、30、60、90 min）、吸附溫度（20、30、40、50 ℃）吸附振蕩速率（0、40、80、120、160 r/min）。其余單因素條件參照基準(zhǔn)條件設(shè)置。

1.2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 11軟件對(duì)Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行設(shè)置，通過較少的實(shí)驗(yàn)步驟，判斷不同因素對(duì)吸附率的重要性。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用n=11的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置，考察了DE添加量、吸附時(shí)間、吸附溫度、振蕩速率對(duì)吸附率的重要性，篩選出3個(gè)對(duì)吸附率有顯著影響的關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置如表1所示。

1.2.4 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 11設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)吸附條件進(jìn)行設(shè)計(jì)、分析和優(yōu)化。結(jié)合PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中心組合設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)了一個(gè)三因素三水平的試驗(yàn)方案，共有15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)點(diǎn)為分析點(diǎn)，其余3個(gè)點(diǎn)為中心組合點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)各因素及其水平設(shè)置如表2所示。

1.2.5 微生物殺菌劑的表征

采用傅立葉紅外光譜測量DE吸附fmbJ前后的變化。室溫條件下進(jìn)行測量，每個(gè)樣本在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行64次掃描，分辨率為4 cm-1。

用環(huán)境掃描電子顯微鏡表征fmbJ吸附前后的DE，用連接到Oxford Xplore檢測器的ZEISS SEM系統(tǒng)用能量色散光譜（EDS）檢測器收集元素?cái)?shù)據(jù)。樣品首先被涂上一層薄薄的金，然后在15～30 kV的加速電壓下以5 000、10 000和20 000的放大倍率觀察。EDS分析是在高倍率（5 000～10 000）下進(jìn)行的。

采用激光粒度儀來測量微生物殺菌劑的粒度。激光粒度分析遵循Microtrac S3500的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。DE的折射率設(shè)定為1.51，每個(gè)樣品測量3次，取平均值并導(dǎo)出數(shù)據(jù)。它提供了體積百分比、分布曲線和顆粒的中位尺寸。顆粒的中值大小被稱為D50。它對(duì)應(yīng)于累積體積的50%。

1.2.6 微生物殺菌劑的抑菌實(shí)驗(yàn)

采用修改過后的瓊脂孔擴(kuò)散法[20]測量微生物制劑是否存在抑菌活性。具體操作如下：接種1 mL霉菌孢子（108 CFU/mL）加入到50 ℃的PDA瓊脂培養(yǎng)基（30 mL）中，充分混合，然后倒入平板。待PDA瓊脂平板凝固后，將10 μL樣品滴加到平板上，在28 ℃下培養(yǎng)72 h，然后觀察其抑制活性。實(shí)驗(yàn)組A：0.1 g/L微生物菌劑溶液（0.1 g溶于1 mL無菌0.9%生理鹽水）；實(shí)驗(yàn)組B：0.05 g/ L微生物菌劑溶液。陰性對(duì)照組C∶0.1 g/L DE溶液；陰性對(duì)照組E：無菌0.9%生理鹽水。陽性對(duì)照D：300 mg/mL丙酸鈣溶液。

1.2.7 微生物殺菌劑的貯藏穩(wěn)定性

取最優(yōu)吸附工藝得到的微生物殺菌劑3份儲(chǔ)存在不同的溫度下（25、4、-20 ℃）。第一個(gè)月每7 d記錄一次存活率，接下來的兩個(gè)月每15 d記錄一次，此后每個(gè)月記錄一次。存活率的計(jì)算公式如式（2）所示。

1.2.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中所有的統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS version 16.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）。顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1（a）可知，DE對(duì)fmbJ的吸附率隨著DE添加量的增加先增加后下降。DE最優(yōu)添加量為0.10 g。

由圖1（b）可知，10 ～ 60 min時(shí)隨著吸附時(shí)間的不斷增加吸附率也不斷增加，但是吸附時(shí)間過長（60～90 min）會(huì)導(dǎo)致其吸附率略有下降。最優(yōu)吸附時(shí)間為60 min。

由圖1（c）可知，隨著吸附溫度的不斷升高，DE對(duì)fmbJ吸附率先升高后下降。最優(yōu)的吸附溫度為30 ℃。

由圖1（d）可知：適當(dāng)提高振蕩速率（0～80 r/min）可以有效提高DE對(duì)fmbJ的吸附率，但是振蕩速率過高（80～160 r/min）則會(huì)導(dǎo)致吸附率下降。最優(yōu)振蕩速率為80 r/min。

2.2 PB實(shí)驗(yàn)

采用PB實(shí)驗(yàn)進(jìn)行單因素之間的挑選，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，比較各因子的兩個(gè)水平之間的差異和總體差異，以確定因子的顯著性差異。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

根據(jù)表3的結(jié)果，進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果（見表4）表明，該模型是顯著的（P = 0.000 2<0.01），且擬合度很好（R2=89.15%）。

根據(jù)表4從4個(gè)因素中挑選出吸附溫度、吸附時(shí)間和振蕩速率進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DE的添加量選取為0.1 g。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以DE對(duì)fmbJ的吸附率為響應(yīng)值，采用吸附時(shí)間、吸附溫度和振蕩速率3個(gè)因素作為因素變量，進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表5。

采用Design-Expert 11軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸模擬，得到模型的二次回歸方程：

二次回歸模型的方差分析結(jié)果（表6）顯示：模型是顯著的（P = 0.006 5<0.01），且方程擬合度很好（R2 = 95.66%）。該模型的失擬項(xiàng)不顯著（P=0.179 9>0.05），說明模型穩(wěn)定，擬合效果好，能很好地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)測[21]。其中交互項(xiàng)AB顯著（P<0.05），二次項(xiàng)A2、B2極顯著（P<0.01）。

圖2（a）表明，在整個(gè)吸附時(shí)間和吸附溫度范圍內(nèi)，一個(gè)參數(shù)的增加而另一個(gè)參數(shù)保持不變，導(dǎo)致吸附率先增加，后減少。圖2（b）和圖2（c）中也觀察到同樣的趨勢。等高線均顯示出橢圓形，說明存在DE對(duì)fmbJ的吸附率最高點(diǎn)。

對(duì)響應(yīng)面模型進(jìn)行優(yōu)化得到最佳吸附條件為：每5 mL的菌液添加0.10 g的DE在29.24 ℃，79.99 r/min的水浴條件下吸附58.48 min，模型預(yù)測吸附率為87.80%。

為了驗(yàn)證模型結(jié)果的有效性，對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行修正，以便于實(shí)驗(yàn)操作。修正后最優(yōu)條件為：每5 mL的菌液添加0.10 g的DE在29 ℃，80 r/min的水浴條件下吸附58 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)DE對(duì)fmbJ的吸附率達(dá)到（89.23±3.08）%，菌數(shù)為5.80×1010 CFU/g。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面模型的預(yù)測結(jié)果基本一致，模型可信。按照最優(yōu)吸附條件制作微生物殺菌劑，并采用FT-TR、SEM-EDS和激光粒度儀等表征實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行表征。

2.4 微生物菌劑的FT-TR分析

采用FT-IR分析干燥的DE（對(duì)照組）和微生物殺菌劑（實(shí)驗(yàn)組）的主要基團(tuán)差別，判斷DE吸附fmbJ方式。圖3的結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組紅外曲線的3個(gè)特征峰的位置主要分布在459、808、1 081 cm-1。其中459 cm-1處的吸收峰是由DE結(jié)構(gòu)中Si—O—Si鍵的彎曲振動(dòng)引起，808、1 081 cm-1處的兩個(gè)吸收峰為DE SiO2結(jié)構(gòu)中Si—O—Si的不對(duì)稱拉伸運(yùn)動(dòng)引起[22]。3 426 cm-1和1 635 cm-1的吸收峰是由Si—O—Si和物理吸附的水分子羥基—OH的拉伸和彎曲振動(dòng)引起[23]。上述結(jié)果表明，制備的微生物試劑干燥后其中無水分，可以很好地保持微生物制劑的穩(wěn)定性。紅外光譜圖顯示在DE吸附fmbJ前后，F(xiàn)T-IR的吸收特征峰未發(fā)生變化，說明DE是通過物理吸附的方式吸附了fmbJ。

2.5 微生物菌劑的粒徑分析

采用激光測量粒度儀測量DE（對(duì)照組）和殺菌劑（實(shí)驗(yàn)組）的粒徑，研究DE對(duì)fmbJ的吸附對(duì)DE完整性的影響，其粒徑參數(shù)見表7。DE吸附fmbJ前后D50基本不變，表明吸附fmbJ未對(duì)DE的結(jié)構(gòu)造成明顯破壞。如果吸附過程中對(duì)吸附載體的破壞過大，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞從載體中漏出，不能很好地吸附fmbJ，導(dǎo)致吸附率下降[24]。

2.6 微生物殺菌劑的SEM-EDS-Mapping分析

采用SEM-EDS-mapping技術(shù)表征微生物殺菌劑。如圖4所示，未吸附fmbJ的DE的表面結(jié)構(gòu)基本完好，表面孔隙形狀比較清晰，孔隙中無異物；吸附fmbJ后DE表面的孔隙被菌體堵塞，孔隙外無異物堆積。這表明DE通過物理吸附的方式將fmbJ吸附包埋于內(nèi)部。

如圖5（a）所示，對(duì)照組DE表面主要元素為Si和O，C和N元素主要集中于背景板。其C、O、Si元素占比分別為34.52%、45.99%、19.49%（表8）。如圖5（b）所示，實(shí)驗(yàn)組DE表面的主要元素組成為C、O和Si。而C元素主要集中在DE被堵塞的孔洞中。其C、O、Si元素占比分別為53.24%、37.04%、9.72%（表8），其主要元素為C和O，為生物體的主要元素。綜上所述，fmbJ被DE吸附包埋于內(nèi)部。

SEM-EDS表征實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DE通過物理吸附的方式將fmbJ吸附于DE內(nèi)部。與吸附在表面相比，吸附于內(nèi)部更穩(wěn)定，不容易脫落，可以在微生物周圍形成一個(gè)保護(hù)屏障，防止細(xì)胞從聚合物泄漏到周圍的介質(zhì)中，同時(shí)允許營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的質(zhì)量轉(zhuǎn)移[24-25]。

2.7 微生物農(nóng)藥的抑菌活性分析

抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DE吸附的fmbJ對(duì)于黑曲霉、黃曲霉和灰綠曲霉等霉菌都具有明顯的抑菌圈，具有顯著的拮抗作用。而丙酸鈣溶液只對(duì)于黑曲霉具有拮抗作用，對(duì)于黃曲霉和灰綠曲霉則無明顯影響，對(duì)比化學(xué)殺菌劑來說，微生物殺菌劑擁有更強(qiáng)的抑菌廣譜性。

2.8 微生物殺菌劑的貯藏實(shí)驗(yàn)分析

表9顯示了微生物殺菌劑在3種不同溫度的貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在室溫條件下（25 ℃），微生物殺菌劑可以在短時(shí)間（0～14 d）內(nèi)維持80%活菌數(shù)（4.64×10¹⁰CFU/g），但隨著貯藏時(shí)間的增加（14～45 d），fmbJ的存活率急劇下降至（55.17±8.67）%（3.20×10¹⁰CFU/g），隨后趨于穩(wěn)定，存活率維持在45%（2.61×10¹⁰CFU/g）左右。當(dāng)貯藏溫度為4 ℃時(shí)，微生物殺菌劑可以在貯藏21 d后依舊維持90%的存活率（5.22×10¹⁰CFU/g），但隨著貯藏時(shí)間的不斷增加（21～120 d）fmbJ存活率緩慢下降，最后存活率保持在70%（4.06×10¹⁰CFU/g）左右。對(duì)于該微生物殺菌劑長期貯藏來說最優(yōu)的貯藏溫度為-20 ℃。此溫度下生物農(nóng)藥在貯藏的初期（0～7 d）存活率明顯降低，隨著貯藏時(shí)間的延長存活率開始緩慢下降（14～21 d），最后維持在80%（4.64×10¹⁰CFU/g）左右。

保質(zhì)期是評(píng)價(jià)微生物殺菌劑優(yōu)劣的重要指標(biāo)。溫度和水分都是影響微生物保質(zhì)期的重要因素[26]。過高的貯藏溫度會(huì)促進(jìn)其氧化反應(yīng)或?qū)е履ぶ|(zhì)相變，從而導(dǎo)致微生物的存活率下降[27]。水分可以改變細(xì)菌的代謝活性、物理和化學(xué)反應(yīng)的速度以及玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，從而影響微生物制劑的穩(wěn)定性[28]。FTIR顯示，干燥完成后的生物農(nóng)藥不含水分，溫度成為影響其儲(chǔ)存的關(guān)鍵因素。微生物殺菌劑的儲(chǔ)存穩(wěn)定性優(yōu)良，于-20 ℃的條件下貯藏180 d依舊可以保持80%（4.64×10¹⁰CFU/g）的存活率。但在25 ℃條件下，微生物殺菌劑中的存活生防菌fmbJ數(shù)量明顯減少，這可能是由于在較高溫度下貯藏導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化或膜脂質(zhì)相變使部分細(xì)菌死亡[29]，與Wang等[30]的研究結(jié)果一致。4、-20 ℃的貯藏條件下，因?yàn)槲⑸锏拇x活性低，低溫下的不良理化反應(yīng)率低從而擁有更優(yōu)良的貯藏穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種以硅藻土為載體吸附解淀粉芽孢桿菌fmbJ制備微生物殺菌劑的方法并通過PB實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了吸附條件。最優(yōu)條件為：每5 mL的菌液添加0.10 g的硅藻土在29 ℃，80 r/min的水浴條件下吸附58 min，該條件下吸附率為（89.23±3.08）%，菌數(shù)為5.80×10¹⁰CFU/g。表征實(shí)驗(yàn)表明，硅藻土通過物理吸附將fmbJ固定在硅藻土內(nèi)部，能夠有效提高生防菌的穩(wěn)定性。抑菌和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用這種方法得到的fmbJ仍然保持了良好的抑菌和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，有作為生物農(nóng)藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的潛力。未來在殺菌劑的使用方式、實(shí)際生產(chǎn)中的使用效果、殺菌劑配方優(yōu)化等方面還可以進(jìn)行進(jìn)一步的探究和應(yīng)用。

參 考 文 獻(xiàn)

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