紙基層析快速提取病毒核酸方法的建立與分析

摘要：目的：建立一種基于紙基層析法的無醇病毒核酸提取方法。方法：通過簡化傳統離心柱操作方法步驟，更換核酸吸附材質為紙基片。操作簡化為三個步驟：即①裂解樣品1～3 min、②紙片吸附核酸與洗滌1 min；③洗脫1 min，整個提取操作過程約5 min左右完成。經實時熒光RT-PCR驗證紙基層析法核酸提取效果。結果：與常規的磁珠法病毒核酸提取方法對照組比較發現，本方法提取效率更高，操作步驟更簡單且省時。結論：紙基層析法提取病毒核酸是一種快捷的方法，不需要額外離心機和磁力裝置，快速實現了病毒DNA和RNA共提，整個操作過程中不加入乙醇或異丙醇，安全、無氯仿苯酚等有毒試劑污染，為我國欠發達地區基層防疫檢疫部門的核酸檢測工作提供了一種經濟實用方法。

關鍵詞：病毒核酸提取；紙基層析；RT-PCR

從復雜生物材料中高效、簡便的提取目的核酸是分子檢測和診斷技術的關鍵。目前病毒核酸純化技術主要分為三種，分別為傳統法、柱膜法和磁珠法。傳統法包括常用的煮沸法和TRIZOL裂解法，煮沸法提取的核酸純度較低，對后續PCR檢測的靈敏度影響較大；TRIZOL裂解法是利用變性劑和表面活性劑進行裂解病毒表面核衣殼結構釋放出核酸，結合苯酚、氯仿抽提去除蛋白等雜質，然后用乙醇或異丙醇進行沉淀獲得核酸，該方法步驟煩瑣，耗時較長、單個樣本約35～55 min完成一輪提取純化[1]；柱膜法是用傳統法升級改進的一種低pH值、高鹽以及含醇的條件下用硅膠膜對核酸進行吸附、然后通過離心將含有胍鹽的乙醇溶液濾過硅膠膜時洗滌去除蛋白等雜質，再用70%～80％的乙醇溶液去除鹽離子，然后自然干燥去除殘留乙醇獲得純化核酸的方法。該方法操作優點是相對簡便，提取的核酸純度高，缺點是是不利于自動化操作、耗時仍然較長、單個樣本約30～45 min完成一輪提取純化。磁珠法與柱膜法類似，主要是用磁性微球替代柱膜吸附核酸，用磁力分離代替離心分離操作，該方法的優點是相對簡便直觀，且能夠在儀器上進行自動化操作；缺點是磁珠吸附核酸的同時容易吸附雜蛋白等雜質獲得高純度的核酸比較困難，成本偏高，耗時仍然較長、單個樣本約25～45 min完成一輪提取純化[2，3]。為進一步提升病毒核酸提取效率、降低成本，本研究以濾紙片為基材進行核酸提取方法的改進。

1 材料

1.1 試劑

鹽酸胍（美侖生物，Lot：J0612A），Tris（pH 8.0），（索萊寶，Cat#T8060），Triton X-100（中杉金橋，Lot：16168），Tween-20（索萊寶，Cat#T8220），蛋白酶K，NaCl（天津天力化學試劑有限公司），EDTA（BBI life sciences，Lot：E416BA0008），氫氧化鈉（天津天力化學試劑有限公司），HEV假病毒顆粒（本實驗室保存）[4]。

1.2 器材

精密分析天平、容量瓶、WhatmanTM 濾紙片、高壓滅菌器、ABI7500fast。

2 方法

2.1 裂解液和洗滌液的配制[2]

裂解液：1～1.5 M鹽酸胍，30～50 mM Tris（pH 8.0），50～100 mM NaCl，5～10 mM EDTA，1% Tween-20（v/v），40 μg/mL蛋白酶K。

洗滌液：Tris（pH 8）10 mM，0.1%Tween-20（v/v）。

2.2 濾紙片的制備

將濾紙裁剪為約25 mm2的紙片或用打孔器制成直徑為6 mm圓形片，干熱滅菌后備用。

2.3 病毒核酸的提取

將2 μL假病毒顆粒混入50 μL豬血清中作為人工模擬樣本[4]，按下述方法進行RNA的提取，驗證該提取方法的可靠性與靈敏性。于1.5 mL無RNA酶的EP管中將人工模擬樣品與四倍體積的裂解液置于離心管中混勻裂解1～3 min。將無菌紙片投入裂解混合液中，室溫孵育吸附1 min，用移液槍吸頭或無菌鑷子將紙片移入200 μL的洗滌液中輕輕震蕩洗滌1 min。取出紙片放入加裝層析棉1.5 mL EP管中去除洗脫液，之后經DEPC無菌水洗脫得到病毒核酸（此步可省略）或直接放入配制好的反轉錄體系中進行cDNA的合成，最終取2～5 μL cDNA模板進行PCR核酸擴增。

1）模擬樣品準備：將2 μL假病毒顆粒混入50 μL豬血清中作為人工模擬樣本，不加假病毒顆粒的血清為空對照。

2）裂解：向1）中各管分別加入200 μL裂解液然震蕩混勻室溫作用1～3 min。

3）吸附：將2）各管裂解樣本分別滴加到紙基層析紙片中央（紙片放入加裝層析棉的1.5mL EP管），逐滴加入待完全吸附。

4）洗滌：向3）各管分別逐滴加入200 μL洗滌液。

5）洗脫：將4）中紙片分別轉移至新的1.5 mL管中，分別加入洗脫液50 μL獲病毒核酸。

2.4 病毒基因的檢測

取上述核酸提取物5 μL放入配制好的反轉錄體系中進行cDNA的合成，最終取2～5 μL cDNA模板進行PCR核酸擴增。

1）所用PCR擴增引物與探針如表1中所示[5]。

2）RT-qPCR反應體系和程序如表2中所示。

3 結果

利用檢測Ct值評價本方法與參與方法的提取效果，實驗結果如表3和圖1所示，RT-qPCR檢測的Ct值記錄。

由圖1和表3可以看出，本提取方法提取得到的HEV假病毒核酸濃度比對照組提取方法中的高（因Ct均值更小），而且重復性接近（CV值均lt;5%）。

4 討論

與對照組試劑盒相比，本研究建立的紙基層析法的病毒核酸提取血清中病毒核酸的效率更高。檢測Ct值均值（11.89）優于對照組（14.6），統計差異極顯著（Plt;0.01，獨立T檢驗），表明本方法的病毒核酸提取濃度更高。另外，本方法整個過程在10min內完成，效率優勢明顯，且進行病毒核酸提取過程中無需貴重儀器、實驗成本相較現有方法明顯降低，適合向臨床即時診斷（POCT）方向推廣發展；本提取方法具有快速、高效且簡易等優點，完全滿足后續PCR或RT-PCR等分子檢測要求[1，2]。與已有技術相比，其技術進步是顯著的，采用獨特的簡易紙基層析介質和無醇裂解液和洗滌液，三步法最終獲得高質量的病毒核酸分子（DNA或RNA），盡管核酸純度仍有提升空間，但該方法為對于相對欠發達地區基層檢疫防疫部門的核酸檢測提供了一種經濟高效的便捷方法，隨著方法優化改進具有廣闊的應用前景。

5 結論

本研究濾紙片方法利用簡易的紙基層析原理進行試劑配方的優化，可以從200 μL樣本中快速捕獲微量病毒核酸，操作流程十分簡便，10 min內即可完成病毒核酸的提取純化，為基層核酸分子檢測提供了一種經濟高效的實用方法。

參考文獻：

[1] 高源，申辛欣，馮志山，等.簡化核酸提取過程在病原體核酸檢測中的應用現狀和發展趨勢[J].病毒學報，2021，37（2）：445-450.

[2] 高慎陽，李丹丹，查恩輝，等.一種紙基層析法病毒核酸提取試劑盒：CN112941068A[P].2021-06-11.

[3 唐蕊華.空間站微生物紙基微流體核酸即時檢測技術的研究[D].西北工業大學，2017.

[4] 劉瑩，王珅，周鐵忠，等.裝載戊型肝炎病毒核酸片段的重組MS2噬菌體衣殼的制備及其特性研究[J].病毒學報，2016，32（5）：538-544.

[5] Jothikumar N， Cromeans TL， Robertson BH， et al. A broadly reactive one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus[J]. J Virol Methods， 2006， 131（1）：65-71.