高劑量阿托伐他汀對肝損傷小鼠膽汁酸代謝的影響及其機制

夏斐斐　宋冰雪　宋雨晴　田嘉偉　閆慧　黃玉曉　辛輝　梁惠

［摘要］ 目的 探討高劑量阿托伐他汀對肝損傷小鼠膽汁酸代謝的影響及其機制。方法 選取SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，隨機分為生理鹽水組（A組）及阿托伐他汀低、中、高劑量組（B、C、D組），每組10只。分別用生理鹽水及10、20、30 mg/kg阿托伐他汀灌胃30 d后，取各組小鼠眼眶血，比較各組小鼠血清總膽汁酸（TBA）、內(nèi)毒素（ET）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）表達水平；取各組小鼠部分肝臟組織，HE染色后觀察肝臟組織病理變化情況，并采用PCR方法檢測肝組織中膽汁酸代謝相關(guān)基因尼酯衍生物X受體（FXR）基因及多藥耐藥相關(guān)蛋白2（MRP2）基因的表達。結(jié)果 D組小鼠肝組織可見輕微腫大樣改變、散在炎癥細胞浸潤和羽毛樣變性情況。與其他組相比，D組小鼠血清TBA、ET、AST、ALT水平均顯著升高（P＜0.05）；與A組相比，C、D組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，D組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論 阿托伐他汀可誘導小鼠血清TBA水平升高，并且導致肝組織中膽汁酸代謝下游相關(guān)基因FXR、MRP2表達改變，大劑量給藥導致的肝組織膽汁酸代謝異常可能是阿托伐他汀肝臟毒性的主要原因之一。

［關(guān)鍵詞］ 阿托伐他??；化學性與藥物性肝損傷；膽汁酸類；代謝；基因表達

［中圖分類號］ R575

［文獻標志碼］ A

INFLUENCE OF HIGH-DOSE ATORVASTATIN ON BILE ACID METABOLISM IN MICE WITH LIVER INJURY AND RELATED MECHANISM＼ XIA Feifei， SONG Bingxue， SONG Yuqing， TIAN Jiawei， YAN Hui， HUANG Yuxiao， XIN Hui， LIANG Hui （Department of Cardiology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

［ABSTRACT］ Objective To investigate the influence of high-dose atorvastatin on bile acid metabolism in mice with liver injury and its mechanism. Methods A total of 40 specific pathogen-free male C57BL/6 mice were randomly divided into normal saline group （group A） and low-， middle-， and high-dose atorvastatin groups （groups B， C， and D， respectively）， with 10 mice in each group. After 30 days of intragastric administration of normal saline and atorvastatin at a dose of 10， 20， and 30 mg/kg， respectively， orbital blood was collected from the mice in each group， and these groups were compared in terms of the serum levels of total bile acid （TBA）， endotoxin （ET）， aspartate aminotransferase （AST）， and alanine aminotransferase （ALT）; after liver tissue samples were collected， HE staining was performed to observe the pathological changes of liver tissue， and PCR was used to measure the mRNA expression levels of the bile acid metabolism-related genes farnesoid X receptor （FXR） and multidrug resis-tance-associated protein 2 （MRP2） in liver tissue. Results The mice in group D had slight swelling， sporadic inflammatory cell infiltration， and feather-like degeneration in liver tissue. Compared with the other groups， group D had significant increases in the serum levels of TBA， ET， AST， and ALT （P<0.05）. Compared with group A， groups C and D had significant reductions in the relative mRNA expression levels of FXR and MRP2 in liver tissue （P<0.05）， and compared with group B， group D had significant reductions in the relative mRNA expression levels of FXR and MRP2 in liver tissue （P<0.05）. Conclusion Atorvastatin can induce the increase in serum TBA level in mice and lead to changes in the expression of the downstream FXR and MRP2 genes associated with bile acid metabolism in liver tissue， and abnormal bile acid metabolism in liver tissue caused by high-dose administration may be one of the main causes of atorvastatin hepatotoxicity.

［KEY WORDS］ Atorvastatin; Chemical and drug induced liver injury; Bile acid; Metabolism; Gene expression

心血管疾病作為全球重大的公共衛(wèi)生問題，是全世界50歲及以上人口的第一大疾病^[1]，而他汀類藥物被廣泛用于血脂代謝以及心血管疾病的防治當中^[2-3]。研究表明，他汀類藥物在使用后會出現(xiàn)血清轉(zhuǎn)氨酶不同程度升高的肝損傷表現(xiàn)^[4-9]，這種藥物性肝損傷可能與他汀類藥物長時間使用導致的膽汁淤積有關(guān)^[10]。膽汁淤積與膽汁酸代謝異常有關(guān)，膽汁酸作為致炎因子，其大量蓄積后將直接激活炎癥遞質(zhì)損害肝細胞，引起肝損傷^[11]。因此探究他汀類藥物對肝臟膽汁酸代謝的影響可為他汀類藥物致肝損傷機制的研究提供一定思路。本研究采用阿托伐他汀建立肝損傷小鼠模型，通過對比不同劑量阿托伐他汀誘導的肝損傷小鼠膽汁酸代謝情況，探討阿托伐他汀影響膽汁酸代謝的相關(guān)機制，以指導他汀類藥物的臨床應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，購買于青島大任富城畜牧有限公司（動物合格證號SCXK[魯]20140007），體質(zhì)量（22.50±1.50）g。小鼠自由進食和飲水，環(huán)境濕度為42%～52%，環(huán)境溫度22～24 ℃，12/12 h交替光照。

1.2 實驗材料

阿托伐他汀藥物購自于石藥集團歐意藥業(yè)有限公司（國藥準字號H20103151），RNAiso plus Trizol（貨號9109）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR047A）及聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒（貨號RR820A）購自于日本TaKaRa公司，F(xiàn)XR、MRP2的上、下游引物購自蘇州金唯智生物科技公司，總膽汁酸（TBA）、內(nèi)毒素（ET）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）等的ELISA試劑盒購自上海恪敏生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及處理 C57BL/6小鼠適應性地喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（A組）及阿托伐他汀低、中、高劑量組（B、C、D組），每組10只。A組小鼠每日給予0.5 mL生理鹽水灌胃1次，B、C、D組每日分別給予10、20、30 mg/kg阿托伐他汀溶液灌胃1次，各組小鼠飼養(yǎng)環(huán)境及條件相同^[12-13]，連續(xù)灌胃給藥30 d。

1.3.2 檢測指標 灌胃30 d后，4組小鼠均于麻醉后采集眼眶血1.2 mL，置于室溫下自然凝固10～20 min，以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液，嚴格按照ELISA試劑盒要求的操作步驟進行血清TBA、ET、AST、ALT指標的檢測。采血完成后斷頸處死所有小鼠，稱量每只小鼠的肝組織與體質(zhì)量，計算兩者比值即肝質(zhì)量指數(shù)。所有小鼠均取部分肝臟組織，固定后送至病理科進行石蠟包埋、切片，并行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理變化情況。取適量各組小鼠肝臟組織加入Trizol提取總RNA，使用紫外分光光度計測定RNA濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；分別取各組小鼠cDNA樣本以及FXR、MRP2的上游和下游引物（FXR的上游引物為5′-GCACGCTGATCAG-ACAGCTA-3′，下游引物為5′-CAGGAGGGTCTG-TTGGTCTG-3′，MRP的上游引物為5′-AATAC-ATGACCTTTTGGTGTTTCTG-3′，下游引物為5′-ACGAAACCGATCAGCAACTT-3′），按照PCR試劑盒說明書要求的步驟進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測，并通過2^-△△CT法計算FXR、MRP2的相對表達量，實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以x?±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量指數(shù)以及肝組織HE染色結(jié)果

A～D組小鼠的體質(zhì)量分別為（31.50±1.20）、（31.40±1.10）、（31.20±0.90）和（30.80±1.00）g，肝質(zhì)量指數(shù)分別為0.45±0.10、0.46±0.11、0.48±0.10和0.47±0.09，B、C、D組小鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)與A組比較差異無顯著性（P＞0.05）。HE染色結(jié)果示A、B、C組小鼠肝臟無明顯病理改變，但D組小鼠部分肝細胞可見輕微腫大樣改變，有散在炎癥細胞浸潤和羽毛樣變性情況（圖1）。

2.2 各組小鼠血清TBA、ET、AST、ALT水平比較

4組小鼠血清TBA、ET、AST、ALT水平比較差異有顯著性（F=11.19～22.84，P＜0.05）；與其他組相比，D組小鼠血清TBA、ET、AST、ALT水平均

2.3 各組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量比較

A～D組小鼠的肝組織中FXR基因的相對表達量分別為0.16±0.03、0.15±0.03、0.11±0.02以及0.09±0.02，MRP2基因的相對表達量分別為0.21±0.05、0.20±0.06、0.13±0.03和0.11±0.02。4組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量比較差異有顯著性（F=7.28、6.69，P＜0.05）；與A組相比，C、D組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量顯著降低（P＜0.05）；與B組相比，D組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量顯著降低（P＜0.05），C、D組間小鼠肝組織中FXR、MRP2基因相對表達量差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

他汀類藥物所帶來的肝臟毒性是近年來心血管藥物領(lǐng)域臨床研究的熱點，研究表明長時間使用他汀類藥物可能會導致肝細胞膜結(jié)構(gòu)變化，引起肝酶滲漏及血液中肝酶升高^[14]。但也有相關(guān)研究指出阿托伐他汀可顯著降低血液中ALT和AST水平，減輕肝損傷^[15]。目前關(guān)于阿托伐他汀導致血清肝酶變化的機制并無確切定論，其主要機制包括細胞蛋白損害、氧化應激、炎癥反應、免疫反應等^[16]，但關(guān)于其肝損傷機制報道卻較少，具體發(fā)病機制也尚不明確。有報道稱，他汀類藥物導致的血清肝酶升高僅僅表現(xiàn)為短暫的、無癥狀的升高，且通常不會超過正常上限的3倍^[17]。另有研究指出，他汀類藥物可能通過介導肝細胞的異常代謝導致膽汁淤積性肝損害^[18]，即藥物引起肝細胞膽管側(cè)膜或肝細胞竇狀隙膜上轉(zhuǎn)運體表達減少、功能障礙，或者抑制膽汁酸及膽鹽排泄相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白活性，導致膽管與轉(zhuǎn)運蛋白損傷^[19-20]。

人體內(nèi)膽汁酸代謝通常處于平衡狀態(tài)，一旦其代謝紊亂，將導致膽汁形成或流動障礙，最終導致肝細胞損傷、肝纖維化甚至肝硬化^[21]。有研究表明，膽汁酸代謝過程中還會引起肝細胞腫大、肝細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積及肝臟體積增大等嚴重肝損害^[22]。本研究為觀察阿托伐他汀的肝毒性，參考阿托伐他汀致其他類型肝損傷的動物實驗方法設(shè)置了低、中、高三種劑量組^[12-13]，結(jié)果顯示各組小鼠灌胃30 d后的體質(zhì)量及肝質(zhì)量指數(shù)比較均無明顯差異，但病理組織HE染色顯示，D組小鼠肝組織存在散在炎癥細胞及輕微羽毛樣變性，此類改變?yōu)槟懼俜e導致肝損傷的特征性病理變化，表明大劑量阿托伐他汀的使用會引起膽汁淤積，誘發(fā)肝損傷。在此基礎(chǔ)上，D組小鼠血清TBA、ET、ALT、AST水平與A、B、C組比較均顯著增高，這同樣提示了大劑量阿托伐他汀帶來的膽汁淤積可能造成的肝損傷，而血清ALT及AST增高則可能為他汀類藥物引起的短暫的、無癥狀升高^[17]。有研究指出阿托伐他汀可以通過其抗炎及抗氧化作用減少ET的產(chǎn)生^[23]，然而本研究中隨著阿托伐他汀劑量增加，血清ET水平卻表現(xiàn)為增高，提示阿托伐他汀可能通過不同的途徑影響ET產(chǎn)生，但兩者之間的影響機制還需要進一步實驗探究。

既往有研究表明，阿托伐他汀及其代謝產(chǎn)物與肝細胞膽管側(cè)膜上膽汁相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白之間聯(lián)系密切^[24]。大劑量使用阿托伐他汀后引發(fā)的膽汁淤積可能是由于藥物改變或抑制了FXR蛋白對肝細胞膽管側(cè)膜上膽汁相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)，從而引起大量膽汁淤積，誘發(fā)肝損傷^[25-26]。本研究比較了各組小鼠的FXR基因以及其下游MRP2基因的相對表達量，結(jié)果顯示與A組相比，C、D組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因表達量顯著減少；與B組相比，D組小鼠肝組織中FXR、MRP2基因表達量顯著減少；說明隨著阿托伐他汀的劑量增加，其對肝組織中FXR、MRP2基因表達的抑制效果愈加明顯。該結(jié)果進一步說明了在阿托伐他汀的使用過程中FXR基因及其下游MRP2基因的變化趨勢是相同的，且阿托伐他汀對膽汁酸代謝的抑制機制可能是其導致膽汁酸代謝異常、膽汁淤積，進而引起肝損傷的主要原因之一。但本研究中隨著阿托伐他汀劑量的增加，C、D組小鼠肝組織中FXR和MRP2基因表達并無差異，提示我們實驗中阿托伐他汀藥物濃度梯度設(shè)定可能較窄，后期我們將會通過加大樣本量和設(shè)置更多濃度梯度進行進一步實驗。

總之，阿托伐他汀可誘導小鼠血清中TBA水平升高，并且導致膽汁酸代謝下游相關(guān)基因FXR、MRP2表達改變，大劑量給藥導致的膽汁酸代謝異常可能是阿托伐他汀肝臟毒性的主要原因之一。倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL-27294）。所有實驗過程均遵照動物實驗的“3R”原則及《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的條例進行。

作者聲明：夏斐斐、宋冰雪、宋雨晴、辛輝、梁惠參與了研究設(shè)計；夏斐斐、宋冰雪、田嘉偉、閆慧、黃玉曉參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強）